Name: optimized transfection strategy for expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in hek-293t cells
Uploaded: 2011-01-19T18:00:00
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Diese Arbeit wurde durch ein Discovery Betriebskostenzuschuss zur JDS aus den Naturwissenschaften und unterstützten Engineering Research Council (NSERC) of Canada, ein NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate-Stipendien (Promotion) (zu A. Senatore) und die Heart and Stroke Foundation, Grant -In-Aid NA # 6284.

<html> 1. Cell Culture <ol><li> Mit 6 mL Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM, Sigma Aldrich) Humane embryonale Nierenzellen 293T-Zellen (HEK-293T, Invitrogen) sind in adhärente Monolayer in entlüftet 25cm 2 Flaschen (; CELLSTAR Greiner Bio-One Zellkultur behandelt) gewachsen, das mit 10 % v / v fötales Rinderserum (FBS; Sigma Aldrich), 1% Natriumpyruvat und 250 ug / ml Penicillin / Streptomycin bei 37 ° C mit 5% CO 2). Die Zellen werden in CO 2-Inkubatoren inkubiert ...

<ol>
	<li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEK293+cell+line:+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins.">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).</li><li>Senatore, A., Spafford, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+and+big+are+key+features+of+an+invertebrate+T-type+channel+(LCav3)+from+the+central+nervous+system+of+Lymnaea+stagnalis.">Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).</li><li>Ogden, D., Stanfield, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+single+channel+and+whole-cell+recording.">Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording.</a> Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook. , (1987).</li><li>Molleman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamping:+an+introductory+guide+to+patch+clamp+electrophysiology.">Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology.</a> , (2003).</li><li>Peng, S. -. Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow-induced+increase+in+inward+Ba2++current+expressed+in+HEK293+cells+transiently+transfected+with+human+neuronal+L-type+Ca2+channels.">Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels.</a> Brain Research. 1045, 116-123 (2005).</li></ol>

<html> Die Möglichkeit, whole-cell Ströme unter Verwendung der beschriebenen Protokolle und Lösungen Datensatz zeigt, dass die Transfektion erfolgreich war und dass die gewünschte Spannung Ionenkanälen oder Ionenkanal-Komplexe vorhanden sind, mit erheblichen Mengen an der Zellmembran. Sollten die Zellen positiv transfiziert werden (dh grün fluoreszierend), aber nicht beschreibbare Strömungen, zusätzliche Zeit bei 28 ° C erforderlich, um für die Kanal-Protein richtig verpackt werden und in die Zellmembran ermög...

<table border="1"><tr><td> Material </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> pIRES2-EGFP-Plasmid </td><td> Clontech </td><td> 6029-1 </td><td></td></tr><tr><td> Kreis Deckgläser </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-545-80 </td><td> Circles Nr. 1 bis 0,13 bis 0,17 mm dick, Größe: 12mm </td></tr><tr><td> Verstärker </td><td> Axon Instruments </td><td> Axopatch 200B oder 700B Multiclamp </td><td></td></tr><tr><td> Data Acquisition System </td><td> Axon Instruments </td><td> Digidata 1440A </td><td></td></tr><tr><td> Elektrophysiologie Software </td><td> Axon Instruments </td><td> pClamp10.1 </td><td></td></tr><tr><td> Pipette Manipulatoren </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td> MPC-385-2 </td><td></td></tr><tr><td> Epifluoreszenz inversen Mikroskop </td><td> Zeiss Kanada </td><td> Axiovert 40 CFL </td><td></td></tr><tr><td> Headstage </td><td> Axon Instruments </td><td> CV-7B </td><td></td></tr><tr><td> Headstage Elektrodenhalter </td><td> Axon Instruments </td><td> 1-HL-U </td><td></td></tr><tr><td> Mikroelektroden-Halter für Masseelektrode </td><td> World Precision Instruments </td><td> MEH3RF 15 </td><td></td></tr><tr><td> Elektrophysiologie Kapillarrohre </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td> BF-150-86 bis 15 </td><td> Borosilikatglas mit Filament, OD 1,5 mm, OD 0.86mm, 15cm lang </td></tr><tr><td> Flaming / Brown Micropipette Puller </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipette Feuer Polierer </td><td> Narishige </td><td> Micro Forge MF-830 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Medikament Perfusionssystem </td><td> AutoMate Scientific </td><td> SmartSquirt8 Valvelink8.2 </td><td></td></tr><tr><td> Drug Perfusionssystem </td><td> AutoMate Scientific </td><td> Valvelink8.2 mit Teflon-Ventile </td><td></td></tr></table>

optimized transfection strategy for expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in hek-293t cells

Die in vitro-Expression und elektrophysiologische Ableitung von rekombinanten Spannungs-gesteuerte Ionenkanäle in kultivierten menschlichen embryonalen Nierenzellen (HEK-293T) ist eine weit verbreitete Forschungsstrategie. HEK-293T-Zellen müssen auf Deckgläschen bei niedrig genug Dichte ausplattiert werden, so dass sie nicht in Kontakt miteinander sind, um für die elektrophysiologische Ableitung ohne verwirrende Effekte durch mit benachbarten Zellen wenden können. Transfizierte Kanäle müssen auch mit hoher Effizienz zum Ausdruck an der Plasmamembran für whole-cell Patch-Clamp-Aufzeichnung von nachweisbaren Ströme über Geräuschpegel. Heterologe Ionenkanäle benötigen oft lange Inkubationszeiten bei 28 ° C nach der Transfektion, um eine ausreichende Membran-Expression zu erreichen, aber es gibt immer mehr Verluste von Zell-Adhäsions-und Deckglas Membranstabilität bei dieser Temperatur. Um dieses Problem zu umgehen, entwickelten wir eine optimierte Strategie zur Transfektion und Platte HEK-293T-Zellen. Diese Methode erfordert, dass die Zellen auf einem relativ hohen Konfluenz transfiziert werden, und bei 28 ° C für unterschiedliche Inkubationszeiten nach der Transfektion für eine angemessene Ionenkanal-Protein-Expression zu ermöglichen. Die transfizierten Zellen werden dann auf Deckgläschen ausplattiert und bei 37 ° C für mehrere Stunden, die für starre Bindung an die Zelle Deckgläser und Membran Restabilisierung ermöglicht. Die Zellen können kurz nach der Beschichtung erfasst werden, oder kann bis 28 ° C für weitere Inkubation übertragen werden. Wir finden, dass die anfängliche Inkubation bei 28 ° C, nach der Transfektion, aber vor dem Ausplattieren Schlüssel für die effiziente Expression heterologer Ionenkanäle, die normalerweise nicht exprimieren auch an der Plasmamembran ist. Positiv transfiziert werden kultivierten Zellen durch Co-Ausdruck eGFP oder eGFP identifiziert ausgedrückt aus einer bicistronischen Vektor (zB pIRES2-EGFP) mit dem rekombinanten Ionenkanal cDNA kurz vor einer internen Ribosomeneintrittsstelle und eine eGFP kodierende Sequenz. Whole-cell Patch-Clamp-Aufzeichnung erfordert spezialisierte Einrichtungen, sowie die Crafting aus poliertem Aufnahme Elektroden und L-förmigen Masseelektroden aus Borosilikatglas. Drug-Delivery zur Pharmakologie von Ionenkanälen Studie kann direkt Mikropipettierung Drogen in die Aufnahme Gericht oder durch Verwendung Mikroperfusion oder Abflussrohre Systeme, die ununterbrochene Ströme von Drogen-Lösung produzieren über aufgezeichneten Zellen erreicht werden.

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Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

Zuverlässige Methode für hocheffiziente<em&gt; In-vitro-</em&gt; Ausdruck und die anschließende elektrophysiologische Ableitung von rekombinanten Spannungs-gesteuerte Ionenkanäle in kultivierten menschlichen embryonalen Nierenzellen (HEK-293T).

Optimierte Transfektion Strategie für Expression und elektrophysiologische Ableitung von rekombinantem Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T-Zellen

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Research

JoVE Journal

Biology

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Patch Clamp Recording von Ionenkanälen in Xenopus Oozyten exprimiert

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Forschung

Biologie

Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

Elektrophysiologischen Methoden für die Aufzeichnung Synaptic Potentials aus dem NMJ von Drosophila-Larven

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Ernte und Vorbereitung Drosophila Embryonen für die elektrophysiologische Ableitung und andere Verfahren

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Elektrophysiologische Aufzeichnung in der Drosophila Embryo

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagenese und funktionale Analyse von Ionenkanälen heterolog in Säugerzellen exprimierten

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

Expression rekombinanter Proteine ​​für Strukturbiologie in HEK 293F Suspensionszellen: eine neue und Barriere Ansatz

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Rekonstitution der ein Transmembranprotein, das spannungsgesteuerten Ionenkanal, KvAP, in Riesen unilamellare Vesikel für Mikroskopie und Patch-Clamp-Studien

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

Multifunktionale, Mikropipette-basierte Methode für den Einbau und Stimulation der bakteriellen mechanosensitiven Ionenkanäle in Droplet Schnittstelle Bilayers

MscL, a large conductance mechanosensitive channel (MSC), is a ubiquitous osmolyte release valve that helps bacteria survive abrupt hypo-osmotic shocks. ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

High Yield Expression von rekombinanten humanen Proteinen mit der transiente Transfektion von HEK293 Zellen in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...