Name: optimized transfection strategy for expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in hek-293t cells
Uploaded: 2011-01-19T18:00:00
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この作品は、グラント、カナダの自然科学と工学研究評議会（NSERC）、NSERCアレクサンダーグラハムベルカナダ大学院奨学金（博士課程）（A. Senatoreまで）と心臓脳卒中財団からJDSに検出動作グラントによってサポートされていました＃6284 NA -補助。

<html> 1。細胞の文化<ol><li> 10で補足した。ダルベッコ改変イーグル培地（シグマアルドリッチDMEM）の6mLを含むヒト胚性腎臓293T細胞（HEK - 293T、Invitrogen社）ベント25センチメートル2フラスコ（グライナーバイオワン; Cellstar扱わ組織培養）で接着単層で増殖させる％（v / v）のウシ胎児血清（FBS;シグマアルドリッチ）、1％ピルビン酸ナトリウム、および37で250μg/ mLのペニシリン/ストレ?...

<ol>
	<li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEK293+cell+line:+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins.">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).</li><li>Senatore, A., Spafford, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+and+big+are+key+features+of+an+invertebrate+T-type+channel+(LCav3)+from+the+central+nervous+system+of+Lymnaea+stagnalis.">Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).</li><li>Ogden, D., Stanfield, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+single+channel+and+whole-cell+recording.">Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording.</a> Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook. , (1987).</li><li>Molleman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamping:+an+introductory+guide+to+patch+clamp+electrophysiology.">Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology.</a> , (2003).</li><li>Peng, S. -. Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow-induced+increase+in+inward+Ba2++current+expressed+in+HEK293+cells+transiently+transfected+with+human+neuronal+L-type+Ca2+channels.">Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels.</a> Brain Research. 1045, 116-123 (2005).</li></ol>

<html>記載されているプロトコルとソリューションを使用して、細胞全体の電流を記録するためにできることは、トランスフェクションが成功したことを、所望の電圧依存性イオンチャネルやイオンチャネル複合体は細胞膜でかなりの量で存在していることを示しています。細胞は積極的にトランスフェクト（すなわち蛍光緑）が記録可能な電流、28で追加のタイム° Cが適切にパッケージ化し?...

<table border="1"><tr><td>材料</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td> pIRES2 - EGFPプラスミド</td><td>クロンテック</td><td> 6029から1 </td><td></td></tr><tr><td>サークルガラスカバースリップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 12-545-80 </td><td>丸1号 - 厚さ0.17ミリメートル〜0.13、サイズ：12ミリメートル</td></tr><tr><td>アンプ</td><td>アクソンインスツルメンツ</td><td> Axopatch 200BまたはMulticlamp 700B </td><td></td></tr><tr><td>データ収集システム</td><td>アクソンインスツルメンツ</td><td> Digidata 1440A </td><td></td></tr><tr><td>電気生理学ソフトウェア</td><td>アクソンインスツルメンツ</td><td> pClamp10.1 </td><td></td></tr><tr><td>ピペットマニピュレータ</td><td>サター器械（株） </td><td> MPC - 385から2 </td><td></td></tr><tr><td>落射蛍光倒立顕微鏡</td><td>ツァイスカナダ</td><td> Axiovert 40 CFL </td><td></td></tr><tr><td>ヘッドステージ</td><td>アクソンインスツルメンツ</td><td> CV - 7B </td><td></td></tr><tr><td>ヘッドステージの電極ホルダー</td><td>アクソンインスツルメンツ</td><td> 1 - HL - U </td><td></td></tr><tr><td>接地電極のための微小電極ホルダー</td><td>世界の精密機器</td><td> MEH3RF 15 </td><td></td></tr><tr><td>電気生理学キャピラリーチューブ</td><td>サター器械（株） </td><td> BF - 150 - 86から15 </td><td>フィラメント、OD 1.5ミリメートル、外径0.86ミリメートル、長い15センチメートルとホウケイ酸ガラス</td></tr><tr><td> /ブラウンマイクロピペットプラーフレイミング</td><td>サター器械（株） </td><td> P - 97 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット火災ポリッシャー</td><td>ナリシゲ</td><td>マイクロフォージMF - 830 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロ薬剤灌流系</td><td>サイエンティフィック自動化</td><td> SmartSquirt8 Valvelink8.2 </td><td></td></tr><tr><td>薬剤の潅流システム</td><td>サイエンティフィック自動化</td><td>テフロンバルブ付きValvelink8.2 </td><td></td></tr></table>

optimized transfection strategy for expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in hek-293t cells

in vitro発現と培養ヒト胚性腎細胞における組換え電位依存性イオンチャネルの電気生理学的記録（HEK - 293T） におけるユビキタス研究の戦略です。彼らは、隣接セルとの接触による交絡影響することなく電気生理学的記録を可能にするために、互いに接触していないようにHEK - 293T細胞は、十分に低い密度でカバーガラス上にプレーティングする必要があります。トランスフェクトされたチャネルは、ノイズレベルを超える検出可能な電流の細胞全体のパッチクランプ記録のための細胞膜に高効率で表現しなければなりません。異種イオンチャネルは、多くの場合、十分な膜発現を達成するために28℃でトランスフェクション後にCを長い潜伏期間が必要ですが、この温度で​​細胞カバースリップの接着と細胞膜の安定性の損失が高まっている。この問題を回避するために、我々は、トランスフェクションとプレートHEK - 293T細胞に最適化された戦略を開発した。このメソッドは、セルが28で比較的高いコンフルエントでトランスフェクトされた、とインキュベートされている必要があります°十分なイオンチャネルタンパク質の発現を可能にするために潜伏期間後のトランスフェクションを変えるためのC。トランスフェクトした細胞をガラスカバースリップ上に播種し、37℃でカバーガラスと膜のrestabilizationに硬い細胞接着を可能にするいくつかの時間、インキュベートする。細胞はすぐにメッキの後に記録することができます、または° C、さらにインキュベーションを28に転送することができます。我々は28時の初期インキュベーション℃で、トランスフェクション後、メッキの前には、通常は細胞膜でも発現しない異種イオンチャネルの効率的な発現のための鍵であることがわかります。積極的にトランスフェクション、培養細胞は、単に上流の内部リボソーム侵入部位およびEGFPをコードする配列のcDNA組換えイオンチャネルを含むバイシストロンベクター（例えばpIRES2 - EGFP）から発現共発現EGFPまたはeGFPので識別されます。ホールセルパッチクランプ記録は、特殊な装置を必要とする、加えて洗練された記録電極とホウケイ酸ガラスからL字型の接地電極の策定。イオンチャネルの薬理学を研究する薬物送達は、直接録音皿に薬をmicropipettingことにより、またはmicroperfusionまたは記録された細胞を介して薬液の中断のないストリームを生成する重力流システムを使用することによって達成することができます。

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Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

高効率、信頼性の高い方法<em&gt; in vitroで</em&gt;発現と培養ヒト胚性腎細胞における組換え電位依存性イオンチャネル（HEK - 293T）のその後の電気生理学的記録。

発現とHEK - 293T細胞における組換え電位依存性イオンチャネルの電気生理学的記録用に最適化されたトランスフェクション戦略

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Research

JoVE Journal

Biology

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Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

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Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

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イオンチャネル研究のためのパッチクランプおよび灌流のテクニックで表さアフリカツメガエル卵母細胞

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Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

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Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

膜貫通タンパク質の再構成、顕微鏡およびパッチクランプ研究のための巨大単膜小胞への電位依存性イオンチャネル、KvAP、

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

液滴界面二重層中に細菌機械受容イオンチャネルの取り込みおよび刺激のための多機能、マイクロピペットベースの方法

MscL, a large conductance mechanosensitive channel (MSC), is a ubiquitous osmolyte release valve that helps bacteria survive abrupt hypo-osmotic shocks. ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

懸濁液中のHEK293細胞の一過性トランスフェクションによる組換えヒトタンパ​​ク質のハイ・イールド式

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...