Name: optimized transfection strategy for expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in hek-293t cells
Uploaded: 2011-01-19T18:00:00
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이 작품은 자연 과학에서 JDS에 디스커버리 운영 부여에 의해 지원되었다 캐나다의 공학 연구 협의회 (NSERC), NSERC 알렉산더 그레이엄 벨 캐나다의 대학원 장학금 (박사) (A. Senatore)을하고 심장과 뇌졸중 재단, 그랜트 # 6284 NA - 인 - 에이드.

<html> 1. 세포 배양 <ol><li> 10과 보충, Dulbecco의 수정 이글스 중간 (시그마 알드리치 DMEM)의 6mL를 포함하는 인간 배아 신장 293T 세포 (HEK - 293T, Invitrogen) 통풍 25cm 2 flasks (그라 이너 바이오 - 하나,, Cellstar 처리 조직 문화)에 자기편 monolayers에서 재배 % V / V 태아 소 혈청 (FBS; 시그마 알드리치), 1 %의 나트륨 pyruvate, 37 250 μg / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신 ° C와 5 % CO 2). 세포 중 37...

<ol>
	<li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEK293+cell+line:+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins.">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).</li><li>Senatore, A., Spafford, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+and+big+are+key+features+of+an+invertebrate+T-type+channel+(LCav3)+from+the+central+nervous+system+of+Lymnaea+stagnalis.">Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).</li><li>Ogden, D., Stanfield, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+single+channel+and+whole-cell+recording.">Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording.</a> Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook. , (1987).</li><li>Molleman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamping:+an+introductory+guide+to+patch+clamp+electrophysiology.">Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology.</a> , (2003).</li><li>Peng, S. -. Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow-induced+increase+in+inward+Ba2++current+expressed+in+HEK293+cells+transiently+transfected+with+human+neuronal+L-type+Ca2+channels.">Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels.</a> Brain Research. 1045, 116-123 (2005).</li></ol>

<html> 설명 프로토콜 및 솔루션을 사용하여 전체 셀 전류를 기록할 수있다는 것은 transfection가 성공하고 원하는 전압 - 게이 티드 이온 채널이나 이온 채널 단지는 세포막에서 상당한 수량에 참석하는 것을 나타냅니다. 세포가 적극적으로 transfected (즉, 형광 녹색)하지만 기록 전류, 28에서 추가 시간 ° C가 제대로 포장하고 세포막에 삽입되는 채널 단백질을 허용해야 할 수 있습니다이 없습니다되어?...

<table border="1"><tr><td> 자료 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 논평 </td></tr><tr><td> pIRES2 - EGFP 플라스미드 </td><td> Clontech </td><td> 6029-1 </td><td></td></tr><tr><td> 서클 유리 coverslips </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> 12-545-80 </td><td> 동아리 번호 1-0.13에 0.17mm 두께, 크기 : 12mm </td></tr><tr><td> 증폭기 </td><td> 액슨 인 스트 루먼트 </td><td> Axopatch 200B 또는 Multiclamp 700B </td><td></td></tr><tr><td> 데이터 수집 시스템 </td><td> 액슨 인 스트 루먼트 </td><td> Digidata 1440A </td><td></td></tr><tr><td> 전기 생리학 소프트웨어 </td><td> 액슨 인 스트 루먼트 </td><td> pClamp10.1 </td><td></td></tr><tr><td> 피펫 manipulators </td><td> 서터 악기 (주) </td><td> MPC - 385-2 </td><td></td></tr><tr><td> Epifluorescence 거꾸로 현미경 </td><td> 자이스 혈구 캐나다 </td><td> Axiovert 40 CFL </td><td></td></tr><tr><td> Headstage </td><td> 액슨 인 스트 루먼트 </td><td> CV - 7B </td><td></td></tr><tr><td> Headstage 전극 홀더 </td><td> 액슨 인 스트 루먼트 </td><td> 1 - HL - U </td><td></td></tr><tr><td> 접지 전극에 대한 Microelectrode 홀더 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> MEH3RF 15 </td><td></td></tr><tr><td> 전기 생리학 모세관 튜브 </td><td> 서터 악기 (주) </td><td> BF - 150 - 86-15 </td><td> 필라멘트, OD 1.5mm, OD 0.86mm, 길이 15cm로 Borosilicate 유리 </td></tr><tr><td> / 브라운 Micropipette 풀러 플라밍 </td><td> 서터 악기 (주) </td><td> P - 97 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipette 화재 폴리셔 </td><td> Narishige </td><td> 마이크로 포지 MF - 830 </td><td></td></tr><tr><td> 마이크로 약물 재관류 시스템 </td><td> 과학 자동화 </td><td> SmartSquirt8 Valvelink8.2 </td><td></td></tr><tr><td> 약물 재관류 시스템 </td><td> 과학 자동화 </td><td> 테프론 밸브와 Valvelink8.2 </td><td></td></tr></table>

optimized transfection strategy for expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in hek-293t cells

체외의 표현과 교양 인간의 배아 신장 세포에 재조합 전압 - 게이 티드 이온 채널 electrophysiological 기록에 (HEK - 293T) 유비 쿼터스 연구 전략이다. 그들은 인접 세포와 접촉으로 인한 혼란함을 주죠 효과없이 electrophysiological 레코딩을위한 수 있도록 서로 접촉되지 않도록 HEK - 293T 세포가 낮은만큼 밀도에 유리 coverslips에 도금해야합니다. Transfected 채널은 또한 소음 수준 이상의 감지 전류를 전체 세포 패치 클램프 레코딩을위한 플라즈마 막 높은 효율로 표현합니다. Heterologous 이온 채널은 종종 ° C transfection 후 적절한 막 표현을 달성하기 위해 28에서 긴 배양 기간을 필요로하지만,이 온도에서 셀 coverslip 부착 및 막 안정성의 손실을가 증가하고 있습니다. 이 문제를 회피하기 위해, 우리는 transfect 및 플레이트 HEK - 293T 세포에 최적화된 전략을 개발했습니다. 이 방법은 세포가 28에서 비교적 높은 confluency에서 transfected하고, incubated 있어야 ° 적절한 이온 채널 단백질 표현을 할 수 있도록 배양 기간 후 transfection 변화를위한 C. Transfected 세포는 다음 유리 coverslips에 도금 및 37 ° C coverslips 및 멤브레인 restabilization에 엄격한 세포 부착을 허용 몇 시간에 대한 incubated 수 있습니다. 전지는 곧 도금 후 녹음하거나 ° C 더 배양을 위해 28 전송할 수 있습니다. 우리는 28의 초기 부화 ° C, transfection 후 있지만 도금하기 전에는 일반적으로 플라즈마 막에서 잘 표현하지 heterologous 이온 채널의 효율적인 표현을위한 열쇠입니다 것을 발견했습니다. 긍정적으로 transfected, 교양 세포는 단지 상류 내부 ribosome 항목 사이트 및 eGFP 코딩 시퀀스의 cDNA 재조합 이온 채널을 포함하는 bicistronic 벡터 (예 : pIRES2 - EGFP)에서 표현 공동 표현 eGFP 또는 eGFP에 의해 식별됩니다. 전체 세포 패치 클램프 녹음 전문 장비를 필요 플러스 borosilicate 유리 광택 기록 전극과 L 자형 접지 전극의 crafting. 이온 채널의 약리학 연구를 마약 배달 직접 녹음 요리로 마약을 micropipetting에 의해, 또는 microperfusion 또는 기록된 세포 이상 약물 솔루션의 중단 흐름을 생산 비중 흐름 시스템을 사용하여 얻을 수 있습니다.

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Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

고효율을위한 신뢰할 수있는 방법<em&gt; 체외에서</em&gt; 표현과 교양 인간의 배아 신장 세포에 재조합 전압 - 게이 티드 이온 채널 (HEK - 293T)의 후속 electrophysiological 기록.

표현과 HEK - 293T 세포의 재조합 전압 - 게이 티드 이온 채널 Electrophysiological 녹음에 최적화된 Transfection 전략

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Research

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Biology

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소설 및 액세스 접근 : 구조 HEK 293F 서스펜션 세포의 생물학에 대한 재조합 단백질 발현

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횡단 단백질의 재구성, 현미경 및 패치 클램프 연구 거대한 단일 층 소포에 전압 게이트 이온 채널, KvAP,

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다기능, 물방울 인터페이스 이중층에서 세균 Mechanosensitive 이온 채널의 설립과 자극에 대한 방법을 마이크로 피펫 기반

MscL, a large conductance mechanosensitive channel (MSC), is a ubiquitous osmolyte release valve that helps bacteria survive abrupt hypo-osmotic shocks. ...

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서스펜션의 HEK293 세포의 과도 형질와 재조합 인간 단백질의 높은 수율 식

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