Name: optimized transfection strategy for expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in hek-293t cells
Uploaded: 2011-01-19T18:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом Discovery Операционная к JDS от естествознания и техники исследовательского совета (NSERC) Канады, NSERC Александр Грэхем Белл Канада Высшее стипендии (докторской) (А. Senatore) и сердца и инсульта фонда, грант -В-Aid Н. А. # 6284.

<html> 1. Культуре клеток <ol><li> Человека эмбриональных почек 293T клеток (НЕК-293T, Invitrogen) выращивают в приверженцем монослоев в вентилируемые 25 см 2 колбы (тканевая культура лечение; Cellstar; Greiner Bio-One), содержащий 6 мл модифицированных орлы Дульбеко Средняя (DMEM; Sigma Aldrich) с добавлением 10 % об. / эм...

<ol>
	<li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEK293+cell+line:+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins.">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).</li><li>Senatore, A., Spafford, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+and+big+are+key+features+of+an+invertebrate+T-type+channel+(LCav3)+from+the+central+nervous+system+of+Lymnaea+stagnalis.">Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).</li><li>Ogden, D., Stanfield, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+single+channel+and+whole-cell+recording.">Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording.</a> Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook. , (1987).</li><li>Molleman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamping:+an+introductory+guide+to+patch+clamp+electrophysiology.">Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology.</a> , (2003).</li><li>Peng, S. -. Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow-induced+increase+in+inward+Ba2++current+expressed+in+HEK293+cells+transiently+transfected+with+human+neuronal+L-type+Ca2+channels.">Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels.</a> Brain Research. 1045, 116-123 (2005).</li></ol>

<html> Возможность записи цельноклеточная токов использованием описанных протоколов и решений показывает, что трансфекция прошла успешно и желаемое напряжения закрытого ионных каналов или комплексы ионного канала присутствуют в значительных количествах в клеточной мембране. Если кле?...

<table border="1"><tr><td> Материал </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Комментарий </td></tr><tr><td> pIRES2-EGFP плазмиды </td><td> Clontech </td><td> 6029-1 </td><td></td></tr><tr><td> Круг стекла покровные </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-545-80 </td><td> Круги № 1 - от 0,13 до 0.17mm толстый, Размер: 12mm </td></tr><tr><td> Усилитель </td><td> Axon инструменты </td><td> Axopatch 200B или 700B Multiclamp </td><td></td></tr><tr><td> Система сбора данных </td><td> Axon инструменты </td><td> DIGIDATA 1440A </td><td></td></tr><tr><td> Электрофизиология Software </td><td> Axon инструменты </td><td> pClamp10.1 </td><td></td></tr><tr><td> Внесите манипуляторы </td><td> Саттер машиностроительный завод </td><td> MPC-385-2 </td><td></td></tr><tr><td> Epifluorescence инвертированного микроскопа </td><td> Zeiss Канаде </td><td> Axiovert 40 CFL </td><td></td></tr><tr><td> Headstage </td><td> Axon инструменты </td><td> CV-7B </td><td></td></tr><tr><td> Держатель электрода Headstage </td><td> Axon инструменты </td><td> 1-HL-U </td><td></td></tr><tr><td> Микроэлектродные держатель для бокового электрода </td><td> Инструменты Всемирного Precision </td><td> MEH3RF 15 </td><td></td></tr><tr><td> Электрофизиология капилляров </td><td> Саттер машиностроительный завод </td><td> BF-150-86-15 </td><td> Боросиликатного стекла с нитью, OD 1,5 мм, диаметр 0.86mm, 15 см </td></tr><tr><td> Горячие / коричневый микропипетки Puller </td><td> Саттер машиностроительный завод </td><td> Р-97 </td><td></td></tr><tr><td> Микропипетки огонь полировщик </td><td> Narishige </td><td> Micro Forge MF-830 </td><td></td></tr><tr><td> Micro наркотиков перфузии системы </td><td> Научно AutoMate </td><td> SmartSquirt8 Valvelink8.2 </td><td></td></tr><tr><td> Система наркотиками перфузии </td><td> Научно AutoMate </td><td> Valvelink8.2 с тефлоновым клапанов </td><td></td></tr></table>

optimized transfection strategy for expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in hek-293t cells

В выражении пробирке и электрофизиологические записи рекомбинантных напряжения закрытого ионных каналов в культуре клеток человеческого эмбриона почки (НЕК-293T) является повсеместной стратегии исследований. НЕК-293T клетки должны быть покрыты на стеклянные покровные при достаточно низкой плотности, так что они не находятся в контакте друг с другом, с тем чтобы позволить электрофизиологические записи не смешивая эффекты из-за контакта с соседними клетками. Трансфицированных каналы также должны выразить с высокой эффективностью в плазме мембраны для цельноклеточной патч зажим записи обнаруживаемых токах выше уровня шума. Гетерологическая ионные каналы часто требует длительного периода инкубации при температуре 28 ° C после трансфекции с целью достижения адекватного выражения мембраны, но Есть увеличения потерь клеточной адгезии и покровное мембраны стабильность при этой температуре. Чтобы обойти эту проблему, мы разработали оптимизированные стратегии для трансфекции и пластины НЕК-293T клеток. Этот метод требует, чтобы клетки трансфицированных быть на достаточно высоком слияния, и инкубировали при 28 ° С в течение различных периодов инкубации после трансфекции, чтобы обеспечить адекватное выражение белка ионного канала. Трансфицированных Затем клетки высевали на покровные стекла и инкубировали при 37 ° С в течение нескольких часов, что позволяет жесткой привязанности ячейки покровные и мембранных restabilization. Клетки могут быть записаны вскоре после металлизации, или может быть передано до 28 ° C для дальнейшей инкубации. Мы считаем, что начальная инкубации при температуре 28 ° C, после трансфекции, но до обшивки, имеет ключевое значение для эффективной экспрессии гетерологичных ионные каналы, которые обычно не экспрессируют также на плазматической мембране. Положительно трансфекции, культивируемых клетках определяются совместно выразили EGFP или EGFP выразил от bicistronic вектор (например, pIRES2-EGFP), содержащий рекомбинантный ионного канала кДНК чуть выше по течению от внутренних рибосомы сайт въезд и EGFP кодирующей последовательности. Всего-клеточные патч зажим записи требует специального оборудования, а также разработке полированных электродов записи и Г-образные электроды почву из боросиликатного стекла. Доставка лекарств для изучения фармакологии ионных каналов может быть достигнуто непосредственно micropipetting наркотиков в записи блюдо, или с помощью microperfusion или самотеком системы, которые производят непрерывный потоки наркотиков решение по записал клеток.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells at JoVE.com

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

Надежный метод высокоэффективной<em&gt; В пробирке</em&gt; Выражения и последующей записи электрофизиологических рекомбинантных напряжения закрытого ионных каналов в культуре клеток человеческого эмбриона почки (НЕК-293T).

Оптимизированная стратегия Трансфекция для выражения и Электрофизиологические Запись рекомбинантных напряжением ионные каналы в НЕК-293T Клетки

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Research

JoVE Journal

Biology

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Патч зажим Запись ионных каналов, выраженные в ооцитов Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

Электрофизиологические методы регистрации синаптические потенциалы от NMJ личинок дрозофилы

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Сбор и подготовка Drosophila Эмбрионы для Электрофизиологические Запись и другие процедуры

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Электрофизиологические Запись в Drosophila Эмбрионов

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Мутагенеза и функционального анализа ионных каналов Heterologously Выраженный в клетках млекопитающих

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Зажим Patch и перфузии Методы изучения ионных каналов, выраженные в Xenopus Ооцитов

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

Рекомбинантный белок Выражение для структурной биологии в НЕК 293F суспензии клеток: роман и доступного подхода,

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Восстановление трансмембранный белок, напряжения закрытого ионного канала, KvAP, в гигантском однослойные везикулы для микроскопии и локальной фиксации исследований

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

Многофункциональный, Микропипетки основе метода для регистрации и стимуляции бактериального механочувствительных ионных каналов в капельной интерфейса Бислои

MscL, a large conductance mechanosensitive channel (MSC), is a ubiquitous osmolyte release valve that helps bacteria survive abrupt hypo-osmotic shocks. ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

High Yield Экспрессия рекомбинантных белков человека с временной трансфекции клеток НЕК293 в виде суспензии

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...