Name: optimized transfection strategy for expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in hek-293t cells
Uploaded: 2011-01-19T18:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells at JoVE.com

Detta arbete stöddes av ett Discovery driftsbidrag till JDS från naturvetenskap och teknik forskningsrådet (NSERC) i Kanada, en NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Stipendier (doktorsavhandling) (till A. SENATORE) och hjärtat och Stroke Foundation, Grant -I-Aid NA # 6284.

<html> 1. Cell Culture <ol><li> Humana embryonala njur 293T celler (HEK-293T, Invitrogen) odlas anhängare monolager i portad 25 cm 2 kolvar (vävnadskultur behandlas, Cellstar, Greiner Bio-One) som innehåller 6 ml av Dulbecco ändrade Eagles Medium (DMEM, Sigma Aldrich) kompletterad med 10 % v / v fetalt bovinserum (FBS, Sigma Aldrich), 1% natrium pyruvat och 250 mikrogram / ​​ml penicillin / streptomycin vid 37 ° C med 5% CO 2). Cellerna inkuberas i CO 2 inkubatorer...

<ol>
	<li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEK293+cell+line:+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins.">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).</li><li>Senatore, A., Spafford, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+and+big+are+key+features+of+an+invertebrate+T-type+channel+(LCav3)+from+the+central+nervous+system+of+Lymnaea+stagnalis.">Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).</li><li>Ogden, D., Stanfield, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+single+channel+and+whole-cell+recording.">Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording.</a> Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook. , (1987).</li><li>Molleman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamping:+an+introductory+guide+to+patch+clamp+electrophysiology.">Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology.</a> , (2003).</li><li>Peng, S. -. Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow-induced+increase+in+inward+Ba2++current+expressed+in+HEK293+cells+transiently+transfected+with+human+neuronal+L-type+Ca2+channels.">Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels.</a> Brain Research. 1045, 116-123 (2005).</li></ol>

<html> Att kunna spela in helcells-strömmar med hjälp av den beskrivna protokoll och lösningar visar att transfektion var framgångsrik och att den önskade spänningskänsliga jonkanaler eller jon komplex kanal finns med betydande mängder i cellmembranet. Om cellerna positivt transfekterade (dvs fluorescerande grön), men har inte inspelningsbar strömmar, extra tid vid 28 ° C kan krävas för att möjliggöra för kanalen proteinet vara ordentligt förpackade och infogas i cellmembranet. Observera att långvarig i...

<table border="1"><tr><td> Material </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> pIRES2-EGFP plasmid </td><td> Clontech </td><td> 6029-1 </td><td></td></tr><tr><td> Circle glas täckglas </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-545-80 </td><td> Cirklar Nr 1 - 0,13 till 0.17mm tjocka, Storlek: 12mm </td></tr><tr><td> Förstärkare </td><td> Axon Instruments </td><td> Axopatch 200B eller Multiclamp 700B </td><td></td></tr><tr><td> Datainsamlingssystem </td><td> Axon Instruments </td><td> Digidata 1440A </td><td></td></tr><tr><td> Elektrofysiologi Software </td><td> Axon Instruments </td><td> pClamp10.1 </td><td></td></tr><tr><td> Pipettera manipulatorer </td><td> Sutter Instrument Co </td><td> MPC-385-2 </td><td></td></tr><tr><td> Epifluorescence inverterat mikroskop </td><td> Zeiss Kanada </td><td> Axiovert 40 CFL </td><td></td></tr><tr><td> Headstage </td><td> Axon Instruments </td><td> CV-7B </td><td></td></tr><tr><td> Headstage elektrodhållare </td><td> Axon Instruments </td><td> 1-HL-U </td><td></td></tr><tr><td> Mikroelektrod hållare för jordelektrod </td><td> Världen precisionsinstrument </td><td> MEH3RF 15 </td><td></td></tr><tr><td> Elektrofysiologi kapillärrör </td><td> Sutter Instrument Co </td><td> BF-150-86-15 </td><td> Borosilikatglas med glödlampa, OD 1.5mm, OD 0.86mm, 15cm lång </td></tr><tr><td> Flaming / Brun Mikropipett Puller </td><td> Sutter Instrument Co </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Mikropipett brand polermaskin </td><td> Narishige </td><td> Micro Forge MF-830 </td><td></td></tr><tr><td> Micro drog perfusion systemet </td><td> Automatisera Vetenskapliga </td><td> SmartSquirt8 Valvelink8.2 </td><td></td></tr><tr><td> Drug perfusion systemet </td><td> Automatisera Vetenskapliga </td><td> Valvelink8.2 med Teflon ventiler </td><td></td></tr></table>

optimized transfection strategy for expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in hek-293t cells

In vitro uttryck och elektrofysiologiska inspelning av rekombinant spänningskänsliga jonkanaler i odlade humana embryonala njur celler (HEK-293T) är en allestädes närvarande forskningsstrategi. HEK-293T cellerna måste vara klädd på glaset täckglas på tillräckligt låg densitet så att de inte har kontakt med varandra för att möjliggöra elektrofysiologiska inspelning utan störande effekter på grund av kontakt med angränsande celler. Transfekterade kanaler måste också uttrycka med hög verkningsgrad vid plasmamembranet för hel-cell patch clamp inspelning av detekterbara strömmar över bullernivåer. Heterologa jonkanaler kräver ofta långa inkubationstider vid 28 ° C efter transfektion för att uppnå tillräcklig membran uttryck, men det finns ökande förluster av cell-täckglas vidhäftning och membranet stabilitet vid denna temperatur. För att kringgå detta problem har vi utvecklat en optimerad strategi att transfektera och plåt HEK-293T celler. Denna metod kräver att celler transfekterade på en relativt hög confluency och inkuberas vid 28 ° C i varierande inkubationstid efter transfektion att möjliggöra adekvat jonkanal protein uttryck. Transfekterade cellerna sedan pläterade på glas täckglas och inkuberas vid 37 ° C under flera timmar, vilket möjliggör för styva cellbindning till täckglas och membran restabilization. Celler kan spelas in strax efter plätering, eller kan överföras till 28 ° C för vidare inkubering. Vi finner att den ursprungliga inkubation vid 28 ° C, efter transfektion men innan plätering, är nyckeln till den effektiva uttryck för heterolog jonkanaler som normalt inte uttrycker bra i plasmamembranet. Positivt transfekterade är odlade celler identifieras av samarbete uttryckta-EGFP eller EGFP uttryck från en bicistronic vektorer (t.ex. pIRES2-EGFP) som innehåller rekombinanta jonkanal cDNA strax uppströms om en intern ribosomen inträde webbplats och en EGFP kodning sekvens. Helcells-patch clamp inspelning kräver specialutrustning, plus hantverk av polerat inspelning elektroder och L-formade elektroder marken från borosilikatglas. Drug delivery att studera farmakologi jonkanaler kan uppnås genom direkt micropipetting narkotika till inspelningen skålen, eller genom att använda microperfusion eller av jordens dragningskraft flödessystem som producerar oavbrutet strömmar av medicinska lösningen över inspelade celler.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells at JoVE.com

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

Tillförlitlig metod för mycket effektiv<em&gt; In vitro</em&gt; Uttryck och efterföljande elektrofysiologiska inspelning av rekombinant spänningskänsliga jonkanaler i odlade humana embryonala njur celler (HEK-293T).

Optimerad Transfektion Strategi för Expression och elektrofysiologiska Inspelningen av rekombinanta spänningskänsliga jonkanaler i HEK-293T celler

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Research

JoVE Journal

Biology

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Patch Clamp Registrering av jonkanaler Uttryckt i Xenopus oocyter

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

Elektrofysiologiska metoder för inspelning Synaptic Potentials från NMJ av Drosophila Larver

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Skörd och förbereda Drosophila Embryon för Elektrofysiologiska inspelning och andra förfaranden

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Elektrofysiologiska Inspelning i Drosophila Embryo

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagenes och funktionsanalys av jonkanaler Uttryckt Heterologously i däggdjursceller

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp och tekniker perfusion för att studera jonkanaler Uttryckt i Xenopus Oocyter

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

Rekombinant proteinuttryck för strukturbiologi i HEK 293F Suspension Celler: A Novel och Accessible Approach

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Beredning av ett transmembranprotein, den spänningskänsliga jonkanaler, KvAP, in Giant enlamellvesiklar för mikroskopi och Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

Multifunktionell, Mikropipett-baserad metod för bildandet och Stimulering av bakteriell Mechanosensitive jonkanaler i dropp Interface bilayers

MscL, a large conductance mechanosensitive channel (MSC), is a ubiquitous osmolyte release valve that helps bacteria survive abrupt hypo-osmotic shocks. ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

Hög Utbyte Expression av rekombinanta humana proteiner med transient transfektion av HEK293 celler i suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...