Name: optimized transfection strategy for expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in hek-293t cells
Uploaded: 2011-01-19T18:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells at JoVE.com

Bu çalışma, Doğa Bilimleri ve JDS Discovery İşletim Grant tarafından desteklenen Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Kanada, NSERC Alexander Graham Bell Kanada Yüksek Lisans Bursu (doktora) (A SENATORE) ve Kalp ve İnme Vakfı, Hibe # 6284 NA-In-Aid.

<html> 1. Hücre Kültürü <ol><li> 10 ile desteklenmiş Dulbecco&#39;nun Modifiye Eagles Medium (Sigma Aldrich DMEM), 6mL içeren İnsan embriyonik böbrek 293T hücreleri (HEK-293T, Invitrogen) Bacalı 25cm 2 şişeler (greiner biyo-one;; Cellstar tedavi doku kültürü) yapışık mono tabakaları büyüdü. % v / v fetal sığır serumu (FBS Sigma Aldrich),% 1 sodyum piruvat ve 250 mg / ml penisilin / streptomisin 37 ° ° C ile% 5 CO 2). Hücreler ya da 37 ° C veya 28 ° C (% 5...

<ol>
	<li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEK293+cell+line:+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins.">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).</li><li>Senatore, A., Spafford, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+and+big+are+key+features+of+an+invertebrate+T-type+channel+(LCav3)+from+the+central+nervous+system+of+Lymnaea+stagnalis.">Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).</li><li>Ogden, D., Stanfield, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+single+channel+and+whole-cell+recording.">Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording.</a> Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook. , (1987).</li><li>Molleman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamping:+an+introductory+guide+to+patch+clamp+electrophysiology.">Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology.</a> , (2003).</li><li>Peng, S. -. Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow-induced+increase+in+inward+Ba2++current+expressed+in+HEK293+cells+transiently+transfected+with+human+neuronal+L-type+Ca2+channels.">Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels.</a> Brain Research. 1045, 116-123 (2005).</li></ol>

<html> Açıklanan protokolleri ve çözümleri kullanarak tam hücreli akımları kaydetmek mümkün transfeksiyon başarılı oldu ve istenen gerilim-kapılı iyon kanalları ya da iyon kanal kompleksleri hücre zarının önemli miktarda mevcut olduğunu gösterir. Hücreleri olumlu transfekte (yani floresan yeşil) ama kaydedilebilir akımları, ek süre 28 ° C düzgün bir şekilde paketlenmiş ve hücre zarının içine eklenecek kanal protein için izin istenebilir yok edilmelidir. Uzun süreli inkübasyon 28 ° ...

<table border="1"><tr><td> Malzeme </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorum </td></tr><tr><td> pIRES2-EGFP plazmid </td><td> Clontech </td><td> 6029-1 </td><td></td></tr><tr><td> Circle cam lamelleri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-545-80 </td><td> Çemberleri No 1 - 0,13 0.17mm kalınlığında, Boyut: 12mm </td></tr><tr><td> Amplifikatör </td><td> Akson Aletleri </td><td> Axopatch 200B veya Multiclamp 700B </td><td></td></tr><tr><td> Veri Toplama Sistemi </td><td> Akson Aletleri </td><td> Digidata 1440A </td><td></td></tr><tr><td> Elektrofizyoloji Yazılım </td><td> Akson Aletleri </td><td> pClamp10.1 </td><td></td></tr><tr><td> Pipet manipülatörler </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td> MPC-385-2 </td><td></td></tr><tr><td> Epifloresans inverted mikroskop </td><td> Zeiss Kanada </td><td> Axiovert 40 CFL </td><td></td></tr><tr><td> Headstage </td><td> Akson Aletleri </td><td> CV-7B </td><td></td></tr><tr><td> Headstage elektrot tutucu </td><td> Akson Aletleri </td><td> 1-HL-U </td><td></td></tr><tr><td> Toprak elektrot Mikroelektrod tutucu </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> MEH3RF 15 </td><td></td></tr><tr><td> Elektrofizyoloji kılcal tüpler </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td> BF-150-86-15 </td><td> Borosilikat cam filament, OD 1.5mm, OD 0.86mm, uzun 15cm </td></tr><tr><td> / Kahverengi Mikropipet Çektirme Flaming </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Mikropipet yangın parlatıcı </td><td> Narishige </td><td> Mikro Forge MF-830 </td><td></td></tr><tr><td> Mikro ilaç perfüzyon sistemi </td><td> Bilimsel AutoMate </td><td> SmartSquirt8 Valvelink8.2 </td><td></td></tr><tr><td> İlaç perfüzyon sistemi </td><td> Bilimsel AutoMate </td><td> Teflon vanalar ile Valvelink8.2 </td><td></td></tr></table>

optimized transfection strategy for expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in hek-293t cells

In vitro ifade ve elektrofizyolojik kayıt kültürlü insan embriyonik böbrek hücrelerinde rekombinant gerilim-kapılı iyon kanalları (HEK-293T), her yerde bir araştırma stratejisi. Komşu hücreler ile temas nedeniyle karıştırıcı etkisi olmadan elektrofizyolojik kayıt için izin vermek için birbirleri ile temas halinde olmayan HEK-293T, böylece hücreleri yeterince düşük yoğunlukta cam lamelleri üzerine kaplama olmalıdır. Transfekte kanalları da gürültü seviyeleri üzerinde saptanabilir akımları tam hücreli yama kelepçe kayıt için plazma membran yüksek verimlilik ile ifade etmelidir. Heterolog iyon kanalları genellikle 28 ° C transfeksiyon sonra yeterli membran ifade elde etmek için uzun inkübasyon süreleri gerektirir, ancak bu sıcaklıkta hücre lamel yapışma ve membran stabilitesi kayıpları artmaktadır. Bu sorunu aşmak için, biz transfect ve plaka HEK-293T hücreleri için optimize edilmiş bir strateji geliştirdi. Bu yöntem hücrelerin nispeten yüksek confluency 28 transfekte ve inkübe olması gerekir ° C yeterli iyon kanalı protein ekspresyonu için izin değişen kuluçka dönemleri post-transfeksiyon. Transfekte hücreler daha sonra cam lamelleri üzerine kaplama ve 37 ° C lamelleri ve membran restabilization sert hücre eki için izin veren birkaç saat inkübe edilir. Hücreler, kısa bir süre kaplama sonra, ya da daha fazla inkübasyon için 28 ° C transfer edilebilir. Biz ilk inkübasyon 28 ° C, transfeksiyon sonra ancak kaplama önce, plazma zarı normalde iyi ifade edemez heterolog iyon kanalları etkin bir şekilde ifade etmek için anahtarı olduğunu bulabilirsiniz. Pozitif transfekte, kültürlü hücreler sadece upstream iç ribozom giriş yeri ve bir eGFP kodlama dizisi cDNA rekombinant iyon kanalı içeren bir bicistronic vektör (örneğin pIRES2-EGFP) ifade, ortak ifade eGFP veya eGFP ile tanımlanır. Tüm hücre yama kelepçe kayıt özel ekipman gerektirir, artı cilalı kayıt elektrotlar ve L şeklindeki zemin elektrotlar borosilikat cam işçiliği. Iyon kanallarının farmakoloji çalışmasında, ilaç dağıtım, doğrudan kayıt çanak içine ilaçlar micropipetting veya microperfusion kaydedilen hücreleri üzerinde kesintisiz akışı ilaç çözüm üretmeye ağırlık akış sistemleri kullanılarak elde edilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells at JoVE.com

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

Yüksek verimli için güvenilir bir yöntem<em&gt; In vitro</em&gt; Ifade ve kültürlü insan embriyonik böbrek hücrelerinde rekombinant gerilim-kapılı iyon kanalları (HEK-293T) sonraki elektrofizyolojik kayıt.

İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Research

JoVE Journal

Biology

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Xenopus Oosit ifade İyon Kanalları Patch Kelepçe Kaydı

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

Drosophila Larva NMJ Synaptic Potansiyeller kayıt için Elektrofizyolojik Yöntemler

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Hasat ve hazırlanması Drosophila</emElektrofizyolojik Kayıt ve Diğer İşlemler> Embriyolar

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Elektrofizyolojik Kayıt Drosophila Embriyo

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

Bir Roman ve Erişilebilir Yaklaşım: Yapısal HEK 293F Askı Hücreleri Biyoloji Rekombinant Protein

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Bir transmembran proteinin yeniden oluşturulması, Mikroskop ve yama kelepçe Çalışmaları Dev tek-katmanlı keseler içine Voltaj kapılı iyon kanalı, KvAP,

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

Çok fonksiyonlu, Damlacık Arayüz Bilayers Bakteriyel Mechanosensitive İyon Kanallarının Kuruluş Ve Uyarım için Yöntemi Mikropipet tabanlı

MscL, a large conductance mechanosensitive channel (MSC), is a ubiquitous osmolyte release valve that helps bacteria survive abrupt hypo-osmotic shocks. ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

Süspansiyon HEK293 hücrelerinin kısa süreli transfection ile Rekombinant İnsan Proteinlerinin Yüksek Verimli İfadesi

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...