Name: physiological recordings of high and low output nmjs on the crayfish leg extensor muscle
Uploaded: 2010-11-17T17:00:00
Duration: 10 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Physiological Recordings of High and Low Output NMJs on the Crayfish Leg Extensor Muscle at JoVE.com

Vi tackar Mr Craig D. Slaven (Engelska institutionen, University of Kentucky) för redaktionell hjälp. Med stöd av University of Kentucky, Institutionen för biologi, Office studierektor och College of Arts &amp; Sciences.

1) Inledning Motoriska nervceller kommunicerar med en muskel fiber med synapser som gemensamt kallas en neuromuskulära förbindelsen (NMJ). NMJs kan nås lätt i de flesta förberedelserna kräftor muskler. Många av de kräftor NMJs demonstrera icke-tillsatta excitatoriska postsynaptiska potentialer (EPSP) liknande den sorterade elektriska signaler som genereras i postsynaptiska dendriter i däggdjurs CNS eller svar subthreshold noteras i ryggradsdjur NMJs (Wiersma &amp; Van Harreveld, 1938, Katz &amp; Kuffler, 1946) . Kräftorna NMJs kan tjäna som grundläggande synaptiska modeller för att ge allmänna insikter i synaptisk transmission och synaptisk differentiering. Generellt Motorenheterna reglera de aspekter av djurens beteende genom den typ av synaptiska kommunikation på NMJs och egenskaper muskler. Sedan den första observationen av &quot;snabba&quot; och &quot;långsam&quot; muskelsammandragningar i krabba och kräftor närmare muskler (Lucas, 1907, 1917), har liknande muskulös kontraktila differentiering har beskrivits i andra typer kräftor muskler t.ex. i buken flexors (Kennedy &amp; Takeda, 1965a , b) och extensorer lem (Van Harreveld &amp; Wiersma, 1936). &quot;Fast&quot; värkarna initiera snabba svar. Till exempel är det kräftstjärtar vända ett snabbt agerande. &quot;Slow&quot; värkarna hålla långsamma rörelser och bidra till att upprätthålla hållningen (Bradacs et al., 1997). Motsvarar &quot;snabbt&quot; och &quot;långsam&quot; muskelsammandragningar, &quot;phasic / hög effekt&quot; och &quot;tonic / låg effekt&quot; är i stort sett används för att beskriva motoriska nervceller. Skillnaden i hastighet och tidpunkten för muskelkontraktion är delvis relaterade till presynaptiska skillnader i synaptiska struktur och synaptiska styrkan (King et al., 1996). Myofibrillar protein isoform uttryck är också viktig i kontraktila skillnader, men i beredningar likt benet extensor muskler, där en given fiber innerveras av båda typerna av motoriska nervceller, ligger fokus på synaptiska skillnader i terminalerna, eftersom terminalerna aktien samma målcellen (Mykles et al., 2002). En tidigare studie undersökte två excitatoriska motoriska axoner av benet extensor och beskrev phasic och tonic fenotyper (Bradacs et al., 1997). I denna rapport visar vi hur du utför dissekering och få inspelningar så att andra kan fortsätta undersöka egenskaperna hos det synaptiska skillnader i dessa nervändslut. Sett med transmissionselektronmikroskopi, olika antal sektioner som erhållits från tonic och phasic terminaler på kräftor benet extensor muskler visade att tonic terminaler innehåller mer RRP blåsor än phasic anslutningar, mitokondrierna är vanligare i tonic nervceller och synapser på phasic terminaler är mer komplexa än de på låg-output synapser, eftersom de innehåller flera aktiva zoner med varierande avstånd (Miller et al, 2002; Johnstone et al, 2008;. King et al, 1996;.. Bradacs et al, 1997). Det låg-utgång tonic terminaler är också mer mottagliga för att öka synaptisk transmission med neuromodulator serotonin (5-HT) än är phasic terminaler (Cooper et al., 2003). Det faktum att tonic och phasic NMJ finns på samma muskelfiber gör det lättare att bedöma presynaptiska skillnader på en viss muskel fiber och ta itu med frågor av muskeltrötthet, synaptisk depression och synaptic överhörningen. Olika frågor återstår att lösa i denna beredning, till exempel om det finns skillnader i den postsynaptiska receptorn densitet och glutamat subtyper receptorn i postsynaptiska mål för tonic och phasic terminaler, men en bättre förståelse av de grundläggande skillnaderna i anatomi och fysiologi av dessa två motoriska enheter kommer stöd till uppbyggnad av en djupare kunskapsbas. Förhoppningen är att de grundläggande principerna lärt sig i denna synaptiska preparatet kommer att tillämpas på andra synapser i olika preparat och kommer att förbättra framtida utredningar i denna synaptiska modellen av kräftor. 2) Metoder <ol><li> Alla experiment utförs på den första eller andra promenader ben av medelstora kräftor (Procambarus clarkii). Djuren är individuella boxar i plast behållare med oxygenized vatten. Temperaturen på djuret rummet är i intervallet 13 ° C-16 ° C. Djuren utfodras med torr fisk mat och vatten byts på en vecka. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1: Schematisk bild av en kräfta promenader benet och sex distala segment. </li><li> Distala delen av promenader benet i ett kräftor är anatomiskt uppdelad i sex segment (Figur 1). Benet extensor ligger i meropodite och nerv bunt som ska isoleras är nära till meropodite ischiopodite gemensamt. Den toniska eller phasic axon kan selektivt stimuleras som needed för fysiologiska ändamål efter de utsätts för. </li><li> Cooper och Cooper (2009) beskrivs några aspekter av den inledande dissektion, inklusive metoder för att avslöja Excitor i öppnaren motor neuron i meropodite regionen, men deras beskrivning inte ger den vård som krävs för att skydda extensor muskler från skador, eftersom det var inte behövs för att ta itu med förberedelserna öppnaren muskeln. För att skydda extensor, är den första eller andra promenader benet bort från kräftor, som mäter 60-10 cm i kroppslängd (Atchafalaya Biological Supply Co, Raceland, LA), genom att förmå djuren att automatisera lem med kraftfulla nyper distalt om frakturen planet i ischiopodite segmentet. Benet är placerad på dissekering plattan med den laterala (yttre sida) vänd mot betraktaren. Benet vrids runt tills betraktaren kan vara säker på utsidan (laterala sidan) är vänd uppåt på dissekering plattan, oftast med välvda uppåt (Figur 2). Placering av benet på en bit papper gör det lättare att vända beredningen samtidigt som dessa nedskärningar. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2: Den laterala sidan av meropodite, vanligtvis den sida som är välvd och är vänd uppåt på dissekering plattan. </li><li> Med en skalpell blad brytare och hållare, har en vass rakblad används för att etsa nagelbanden tills bara skära igenom i det mönster som visas i figur 3 för meropodite segmentet. Man ser till att inte skära för långt distalt på rygg för att ventrala skära av meropodite-carpopodite gemensamt. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig3.jpg" alt="Figur 3" /> Figur 3: meropodite segment med linjer som föreslagits mönster för etsning ut genom fönstret på nagelbanden. Beredningen är placerad i koksaltlösning. Den dissektion maträtt bör ha en Sylgard (Dow Corning) beläggning på undersidan (1 cm tjock). Den Sylgard används så att insekten stift kan fastna i den för att hålla beredningen fortfarande. Vid denna punkt, är ett stift har fastnat i mitten av carpopodite segmentet och i dorsala delen av ischiopodite segment (Figur 4). Dissekerade förberedelser badar i vanliga kräftor saltlösning, modifierad från Van Harreveld s lösning (1936), som är gjord med 205 NaCl, 5.3KCl, 13,5 CaCl 2, 2H 2 O, 2,45 MgCl 2, 6H 2 O, 5 HEPES och anpassas till pH 7,4 (i mm). <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig4.jpg" alt="Figur 4" /> Figur 4: meropodite segment med skära fönster lyfts bort. Observera platsen för dissekering stift. </li><li> Nagelbanden är försiktigt lyfts i distala region och muskelfibrer skärs bort från nagelbanden genom att göra slag mot basen av benet. Nagelbanden kan lyftas av. </li><li> Den apodeme (senan) skärs i meropodite-carpopodite gemensamt. En nål placeras på insidan av flexor senan för att visa var snittet ska göras (Figur 5). Senan är då kläms där det skars med pincett och flexor musklerna dras av genom att lyfta den i en caudal riktning (Figur 6), utsätta de viktigaste benet nerv och extensor muskler. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig5.jpg" alt="Figur 5" /> Figur 5: apodeme av flexor muskel är markerad genom att tränga undan den från flexor med en nål. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig6.jpg" alt="Figur 6" /> Figur 6: apodeme av flexor musklerna bryts och tas bort med omsorg för att inte skada de viktigaste benet nerv. </li><li> Den viktigaste benet nerven skärs i meropodite-carpopodite gemensamt och försiktigt dras tillbaka över extensor muskler. Den mediala ytan av muskeln används i hela denna studie. Separationen av nerven till extensor muskler från den huvudsakliga benet nerv kan förbättras genom att försiktigt dra den distala stumpen av de viktigaste benet nerven vid sidan av preparatet. När peeling de viktigaste benet nerven tillbaka över extensor muskeln kan små grenar av Axon behöva sänkas. Dessa grenar från den inhibitoriska motor neuron till extensor muskler. De större bunt förgreningar från de största benet nerven nära den proximala änden av meropodite är den lilla nerv bunt av intresse. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig7.jpg" alt="Figur 7" /> Figur 7: Den viktigaste benet nerv skärs och drog tillbaka i en proximal riktning. Denna nerv bunt kan ses med metylenblått färgning (Figur 8) eller med 4-Di-2-ASP fluorescerande färgning (Figur 9). <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig8.jpg" alt="Figur 8" /> Figur 8: De extensor muskler som färgats med metylenblått. Notera axonet förgrening och de två väl synliga axoner i synnerven. Röda pilarna Demark nerven spåret. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig9.jpg" alt="Figur 9" /><br/&gt; Figur 9: axoner av motorn nerv färgats med 4-Di-2-ASP. Den tonic Axon är mer ljust synlig grund av den ökade mitokondriella innehåll. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig10a.jpg" alt="Figur 10A" /> Figur 10A: Individuella terminaler phasic och tonic nervceller färgats med 4-Di-2-ASP. Notera varicosities på tonic terminaler och tunna natur phasic terminaler. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig10b.jpg" alt="Figur 10B" /> Figur 10B-Tonic noteras <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig10c.jpg" alt="Figur 10C" /> Figur 10C-Phasic noteras </li></ol> 3) Fysiologiska Profiler <ol><li> För att observera den excitatoriska postsynaptiska potentialer (epsps) av tonic eller phasic nervceller, är en av de isolerade axoner i nervknippen stimuleras av ett sug elektrod (Figur 11) är ansluten till en Grass stimulator samtidigt intracellulär potential i muskeln kontrolleras (Johnstone et al., 2008). Stimulering vid 70 Hz appliceras på tonic axonet i syfte att främja ett förenklat svar för låg produktion NMJs, eller en enstaka puls (1 Hz) tillämpas på phasic axonet för att få stora epsps av den höga produktionen NMJs som visas i figur 12. Den EPSPS registreras till en dator via en PowerLab/4s gränssnitt. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig11.jpg" alt="Figur 11" /> Figur 11: Stimulera elektrod placerad över en enda axon inom nerv bunt. Notera den gröna linjen beskriver två huvudsakliga axoner. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig12.jpg" alt="Figur 12" /> Figur 12: postsynaptiska potentialer (epsps) av tonic eller phasic nervceller som erhålls genom intracellulära inspelningar. </li><li> Utredning i naturen av synaptiska underlättande och synaptisk depression kan bli kontaktade av olika experimentella paradigm med låg och hög effekt NMJs. Underlättande av låg produktion NMJs beror på frekvensen, som visas för de 20, 40 och 60 Hz pulser på cirka 20 stimuli (Figur 13). <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig13.jpg" alt="Figur 13" /> Figur 13: EPSPS som svar på ett tåg av stimulering pulser ges vid tre olika frekvenser 20, 40 och 60 Hz i normal kräftor saltlösning. </li><li> Graden av synaptisk depression frekvens av stimulering är också relaterad till hög effekt NMJs. Figur 14 visar en kontinuerlig 5 Hz av stimulering trycka på NMJ över 30 min. Med högre stimulans frekvens, kommer preparatet hämmar snabbare (Bradacs et al., 1997). <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig14.jpg" alt="Figur 14" /> Figur 14: EPSP amplitud phasic svar under 5 Hz stimulering för att framkalla depression. </li></ol> 4) Quantal Responses <ol><li> Ett förfarande liknande det som beskrivs för öppnaren muskeln i kräftor (Cooper och Cooper, 2009) används i denna beredning. Den quantal EPSPS direkt över identifierbara delar av nervändsluten registreras genom att placera lumen i ett makro-patch inspelning elektrod på synaptisk varicosities visualiseras med den vitala färgämnet 4-Di-2-Asp (5 mikroM, 5-min behandling, Cooper et al, 1995;. Magrassi et al, 1987).. Den spontana såväl som framkallat quantal svar kan registreras längs nervändslut. Den framkallade och spontant synaptiska potentialer är inspelade med makro-patch elektrod (Dudel, 1981; Wojtowicz et al, 1991;. Mallart, 1993). Kimax glas (ytterdiameter: 1,5 mm) drogs och brand-polerade för att producera patch tips med innerdiametrar från 10 till 20 m (Figur 15). <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig15.jpg" alt="Figur 15" /> Figur 15: lumen i ett makro-patch inspelning elektrod. Lumen i elektroden är fylld med bad-mediet. Förstärkaren är den samma som används för den intracellulära inspelningar som nämns ovan. Elektrod och tätning motstånd kan bestämmas genom att testa strömpulser genom elektroden. I våra experiment varierade sigill motstånd från 0,3 till 1,0 MOhm och elektroden motståndet varierade från 0,5 till 1,0 Mohm. Seal motstånd kan övervakas under hela inspelningen. </li><li> Direkt räkning av quantal händelser som är möjligt med låga stimulering frekvenser. För varje framkallat svar kan antalet quantal händelser lätt bestämmas för den låga utgångar (Figur 16). Dessa direkta räknas kan uppskatta den genomsnittliga quantal innehållet (Del Castillo &amp; Katz, 1954;. Cooper et al, 1995). Sedan väckte hög effekt NMJs producera flera quantal framkallade händelser, den genomsnittliga amplituden eller område där nedböjningar, tillsammans med den genomsnittliga maximala amplitud eller område där spontana händelser kan användas för att lämpligaximate medelvärdet quantal innehållet (Cooper et al., 1995). <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig16.jpg" alt="Figur 16" /> Figur 16 Fokal spår som spelats in från en phasic och en tonic NMJ. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig17.jpg" alt="Figur 17" /> Figur 17 </li></ol>

<ol>
	<li>Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+synaptic+physiology+of+crustacean+neuromuscular+systems.">Organization and synaptic physiology of crustacean neuromuscular systems.</a> Prog. Neurobiol. 7, 291-391 (1976).</li><li>Atwood, H. L., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+diversity+and+differentiation:+Crustacean+neuromuscular+junctions.">Synaptic diversity and differentiation: Crustacean neuromuscular junctions.</a> Invertebrate Neuroscience. 1, 291-307 (1996).</li><li>Bradacs, H., Cooper, R. L., Msghina, M., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+physiology+and+morphology+of+phasic+and+tonic+motor+axons+in+a+crayfish+limb+extensor+muscle.">Differential physiology and morphology of phasic and tonic motor axons in a crayfish limb extensor muscle.</a> J. Exp. Biol. 200, 677-691 (1997).</li><li>Cooper, R. L., Stewart, B. A., Wojtowicz, J. M., Wang, S., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+measurement+and+analysis+methods+compared+for+crayfish+and+Drosophila+neuromuscular+junctions,+and+rat+hippocampus.">Quantal measurement and analysis methods compared for crayfish and Drosophila neuromuscular junctions, and rat hippocampus.</a> J. Neurosci Methods. 61, 67-78 (1995).</li><li>Cooper, R. L., Donmezer, A., Shearer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+differences+in+sensitivity+to+5-HT+between+high-+and+low-output+terminals+innervating+the+same+target.">Intrinsic differences in sensitivity to 5-HT between high- and low-output terminals innervating the same target.</a> Neuroscience Research. 45, 163-172 (2003).</li><li>Cooper, A. S., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+view+and+demonstration+of+physiology+at+the+NMJ+at+the+crayfish+opener+muscle.">Historical view and demonstration of physiology at the NMJ at the crayfish opener muscle.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Del Castillo, J., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+components+of+the+end-plate+potential.">Quantal components of the end-plate potential.</a> J. Physiol. 124, 560-573 (1954).</li><li>Desai-Shah, M., Viele, K., Sparks, G., Nadolski, J., Hayden, B., Srinivasan, V. K., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+synaptic+function+during+short-term+facilitation+in+motor+nerve+terminals+in+the+crayfish.">Assessment of synaptic function during short-term facilitation in motor nerve terminals in the crayfish.</a> The Open Neuroscience Journal. 2, 24-35 (2008).</li><li>Desai-Shah, M., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+mechanisms+of+Ca2++regulation+that+influence+synaptic+transmission:+Comparison+between+crayfish+and+Drosophila+neuromuscular+junctions.">Different mechanisms of Ca2+ regulation that influence synaptic transmission: Comparison between crayfish and Drosophila neuromuscular junctions.</a> SYNAPSE. 63, 1100-1121 (2009).</li><li>Dudel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+reduced+calcium+on+quantal+unit+at+the+crayfish+neuromuscular+junction.">The effect of reduced calcium on quantal unit at the crayfish neuromuscular junction.</a> Pfl gers Arch. 391, 35-40 (1981).</li><li>Griffis, B., Moffett, S., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+phenotype+remains+unaltered+after+limb+autotomy+and+unloading.">Muscle phenotype remains unaltered after limb autotomy and unloading.</a> J. Exp. Zool. 289, 10-22 (2001).</li><li>Harata, N., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Mozhayeva, M., Kavalai, E. T., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+numbers+of+recycling+vesicles+in+small+CNS+nerve+terminals:+implications+for+neural+signaling+and+vesicular+cycling.">Limited numbers of recycling vesicles in small CNS nerve terminals: implications for neural signaling and vesicular cycling.</a> Trends in Neurosci. 24, 637-643 (2001).</li><li>Jeromin, A., Shayan, A. J., Msghina, M., Roder, J., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crustacean+frequenins:+molecular+cloning+and+differential+localization+at+neuromuscular+junctions.">Crustacean frequenins: molecular cloning and differential localization at neuromuscular junctions.</a> J. Neurobiol. 41 (2), 165-175 (1999).</li><li>Johnstone, A. F. M., Kellie, S., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+depression+in+phasic+motor+nerve+terminals+and+influence+of+5-HT+on+docked+vesicles.">Presynaptic depression in phasic motor nerve terminals and influence of 5-HT on docked vesicles.</a> The Open Neuroscience Journal. 2, 16-23 (2008).</li><li>Katz, B., Kuffler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation+of+the+nerve-muscle+system+in+Crustacea.">Excitation of the nerve-muscle system in Crustacea.</a> Proc. Roy. Soc. B. 133, 374-389 (1946).</li><li>Kennedy, D., Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflex+control+of+abdominal+flexor+muscles+in+crayfish.+I.+The+twitch+system.">Reflex control of abdominal flexor muscles in crayfish. I. The twitch system.</a> J. Exp. Biol. 43, 211-227 (1965).</li><li>Kennedy, D., Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflex+control+of+abdominal+flexor+muscles+in+crayfish.+II.+The+tonic+system.">Reflex control of abdominal flexor muscles in crayfish. II. The tonic system.</a> J. Exp. Biol. 43, 229-246 (1965).</li><li>King, M. J. R., Atwood, H. L., Govind, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+features+of+crayfish+phasic+and+tonic+neuromuscular+junctions.">Structural features of crayfish phasic and tonic neuromuscular junctions.</a> J. Comp. Neurol. 372, 618-626 (1996).</li><li>LaFramboise, W., Griffis, B., Bonner, P., Warren, W., Scalise, D., Guthrie, R. D., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+type+specific+myosin+isoforms+in+crustacean+muscles.">Muscle type specific myosin isoforms in crustacean muscles.</a> J. Exp. Zool. 286, 36-48 (2000).</li><li>Logsdon, S., Johnstone, A. F. M., Viele, K., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+synaptic+vesicles+pools+within+motor+nerve+terminals+during+short-term+facilitation+and+neuromodulation.">Regulation of synaptic vesicles pools within motor nerve terminals during short-term facilitation and neuromodulation.</a> J. Applied Physiol. 100, 662-671 (2006).</li><li>Lucas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+complex+excitable+tissues+by+their+response+to+electric+currents+of+short+duration.">The analysis of complex excitable tissues by their response to electric currents of short duration.</a> J. Physiol. 35, 310-331 (1907).</li><li>Lucas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+summation+of+propagated+disturbances+in+the+claw+of+Astacus+and+on+the+double+neuromuscular+system+of+the+abductor.">On summation of propagated disturbances in the claw of Astacus and on the double neuromuscular system of the abductor.</a> J. Physiol. 51, 1-35 (1917).</li><li>Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+that+stain+living+nerve+terminals.">Fluorescent probes that stain living nerve terminals.</a> J. Neurosci. 7, 1207-1214 (1987).</li><li>Millar, A. G., Bradacs, H., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverse+relationship+between+release+probability+and+readily+releasable+vesicles+in+depressing+and+facilitating+synapses.">Inverse relationship between release probability and readily releasable vesicles in depressing and facilitating synapses.</a> J. Neurosci. 22, 9661-9667 (2002).</li><li>Millar, A. G., Zucker, R. S., Ellis-Davies, C. G., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sensitivity+of+neurotransmitter+release+differs+at+phasic+and+tonic+synapses.">Calcium sensitivity of neurotransmitter release differs at phasic and tonic synapses.</a> J. Neurosci. 25, 3113-3125 (2005).</li><li>Msghina, M., Govind, C. K., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+structure+and+transmitter+release+in+crustacean+phasic+and+tonic+motor+neurons.">Synaptic structure and transmitter release in crustacean phasic and tonic motor neurons.</a> J. Neurosci. 18, 1374-1382 (1998).</li><li>Msghina, M., Millar, A. G., Charlton, M. P., Govind, C. K., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+entry+related+to+active+zones+and+differences+in+transmitter+release+at+phasic+and+tonic+synapses.">Calcium entry related to active zones and differences in transmitter release at phasic and tonic synapses.</a> J. Neurosci. 19, 8419-8434 (1999).</li><li>Mykles, D. L., Medler, S. A., Koenders, A., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibrillar+protein+isoform+expression+is+correlated+with+synaptic+efficacy+in+slow+fibres+of+the+claw+and+leg+opener+muscles+of+crayfish+and.">Myofibrillar protein isoform expression is correlated with synaptic efficacy in slow fibres of the claw and leg opener muscles of crayfish and.</a> 205 (4), 513-522 (2002).</li><li>Sparks, G., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-HT+offsets+homeostasis+of+synaptic+transmission+during+short-term+facilitation.">5-HT offsets homeostasis of synaptic transmission during short-term facilitation.</a> J. Applied Physiol. 96, 1681-1690 (2004).</li><li>Sohn, J., Mykles, D. L., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomical,+physiological+and+biochemical+characterization+of+muscles+associated+with+the+articulating+membrane+in+the+dorsal+surface+of+the+crayfish+abdomen.">The anatomical, physiological and biochemical characterization of muscles associated with the articulating membrane in the dorsal surface of the crayfish abdomen.</a> J. Exp. Zool. 287, 353-377 (2004).</li><li>Tsien, R. W., Harata, N. C., Choi, S. W. P. y. l. e., Aravanis, A. M., AM, G. C. h. e. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicles,+quanta+and+synaptic+plasticity.+Molecular+Mechanisms+of+synaptic+function.">Vesicles, quanta and synaptic plasticity. Molecular Mechanisms of synaptic function.</a> , (2001).</li><li>Van Harreveld, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiological+solution+for+freshwater+crustaceans.">A physiological solution for freshwater crustaceans.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 34, 428-432 (1936).</li><li>Van Harreveld, A., Wiersma, C. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+triple+innervation+of+the+crayfish+muscle.">The triple innervation of the crayfish muscle.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 22, 667-667 (1936).</li><li>Wiersma, C. A. G., Van Harreveld, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+the+frequency+of+stimulation+on+the+slow+and+fast+contraction+in+crustacean+muscle.">The influence of the frequency of stimulation on the slow and fast contraction in crustacean muscle.</a> Physiol. Zool. 11, 75-81 (1938).</li><li>Wojtowicz, J. M., Smith, B. R., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+recruitment+of+silent+synapses.">Activity-dependent recruitment of silent synapses.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 627, 169-179 (1991).</li></ol>

Vi har visat i denna rapport hur man dissekera, spela in och mäta synaptiska svar i en unik kräftor neuromuskulär förberedelse där både hög och låg-utgångsplintar innerverar samma muskelfiber. Den neuromuskulära förberedelser i kräftor erbjuder många fördelar jämfört med ryggradsdjur neuromuskulära korsningar, eftersom endast ett fåtal excitatoriska motoriska nervceller behövs för att innerverar en muskel, och eftersom nervceller kan identifieras från förberedelse till förberedelse (Atwood, 1976). Dessutom är den excitatoriska neurotransmittorn glutamat, och den excitatoriska postsynaptiska potentialer (EPSP) är graderade, alltså, de biofysiska egenskaper graderade händelser är analogt med dendriter av nervceller i CNS hos ryggradsdjur. Den quantal strömmar, kan dock följas direkt på postsynaptiska webbplatser (Cooper et al., 1995). Repetitiva 5 Hz stimulering av phasic nerv ger upphov till stora EPSPS som i hög grad blir deprimerade efter flera minuter. Denna typ av depression är vanligt i leddjur phasic neuromuskulära korsningar (Atwood och Cooper, 1996). Förekomst av tonic terminaler längs phasic terminalerna gör att man kan bedöma om den postsynaptiska mål är kraftigt modifierad under och efter depressionen under phasic motoriska neuron. Dessutom låg utgångar ger en fin förberedelse för att undersöka mekanismerna som ligger bakom synaptiska underlättande (Desai-Shah et al, 2008;. Desai-Shah och Cooper, 2009) Den höga utgångarna ger en lekplats för att undersöka modulering i graden av synaptiska depression och återhämtningsprocessen. Tillgängliga och livskraftiga preparat bör hjälpa till att dechiffrera mekanismerna bakom synaptisk depression. I detta kräftor benböjning beredning, är exogen tillämpning av serotonin annat verktyg för att undersöka återvinning av synaptiska depression och eventuellt ett sätt att främja utredningen av mobiliseringen av synaptiska vesikler pooler. Detta preparat innehåller flera experimentella fördelar, eftersom enskilda muskelfibrer innerveras av både phasic och tonic motoriska nervceller. Eftersom serotonin ökar antalet blåsor som släpps med framkallade stimulans, och eftersom det främjar återhämtning under depression, är det uppenbart att det finns en viss modulering av vesikler pooler för att öka sannolikheten för fusion med serotonin närvarande (Johnstone et al. 2008 ; Logsdon et al, 2006;. Sparks et al, 2004).. Modeller som skulle förklara dynamiken i vesikler pooler inom presynaptiska nervändsluten under lågfrekvent stimulering, i motsats till en deprimerad tillstånd, måste också anses vara bland de olika experimentella protokoll som är möjliga med denna beredning. Det har konstaterats i andra system att ca 30% av vesikler poolen genomgår en snabb återvinning, medan resten av återvunna blåsor gå igenom en traditionell långsam återvinning väg genom endoplasmatiska retiklet (Harata et al, 2001;. Tsien et al. , 2001). Sådana dubbla vägar kan också finnas i detta system. Om ATP saknas i den deprimerade tillståndet i presynaptiska terminalen, då lastning och lossning kanske inte kan ske, och därför skulle många fler lossas blåsor kvar på synaptiska ytan. Eftersom fler blåsor snabbt frigörs när terminalerna är utsatta för 5 HT, är det möjligt att mer ryms inom de lätt öppningsbara poolen (RRV). Men i sitt deprimerade tillstånd med minskad ATP kan lastning och lossning blockeras även i närvaro av 5 HT, som återigen lämnar lossas blåsor vid synaptisk ytan. Eftersom de preliminära uppgifterna tyder på att fler blåsor släpps över tiden med förlängd 5 HT exponering och stimulans, fördelningen av vesikler poolen från den snabba och långsamma återvinning vägar kan vara sned att ha kompetenta vesikler för ny-release (från Johnstone et al. 2008; se recensioner-Desai-Shah et al, 2008;. Desai-Shah och Cooper, 2009) Med de metoder för centrala macropatch inspelningar av postsynaptiska strömmar och åtgärder av enskilda kvanta från definierade områden av motorn nervändsluten kan man ställa frågor för att avgöra om synaptisk depression sker som en följd av färre blåsor släpps eller på grund av förändringar i funktionen av postsynaptiska receptorer. Det har visat att blåsor är mer känsliga för fusion vid phasic NMJ av denna förberedelse för en lika kalcium exponering (Miller et al. 2005), som sannolikt står för den högre genomsnittligt quantal innehåll phasic terminaler (Msghina et al. , 1998, 1999). Dessutom kan skillnader i kalcium bindande protein frequenin (Jeromin et al., 1999) och ultrastruktur (King et al., 1996) bidrar till den differentiella synaptiska effekten (Cooperet al., 2003). Vissa tidigare studier har utforskat muskler fenotyp av extensor muskelfibrer (Bradacs et al, 1997;. Cooper et al, 2003.). Jämföra regleringen av muskeln differentiering för rent tonic och phasic fibertyper i kräftor till blandade fibertyper, som till benet extensor som slött är innerveras kan ge ledtrådar till muskler fenotyp uttryck och reglering (Laframboise et al, 2000;. Sohn et al, 2000;. Griffis et al, 2001;. Mykles et al, 2002).. Många grundläggande frågor återstår att behandlas i neurobiologi, och denna förberedelse kan stödet i kampen mot några av dem. Några frågor av intresse inom området idag som skulle kunna närma sig med benet extensor är: 1) Fastställande av cellulära mekanismer som ligger bakom synaptisk depression inom hög-utgångar (Är depression på grund av en minskning av Ca2 + inträde, avsaknaden av en behörig lätt öppningsbara vesikler (RRV) pool, och / eller ändras postsynaptiska mottaglighet?) 2) Fastställande av mekanistiska rollen av 5-HT när den tillämpas efter induktion av synaptiska depression för att främja en snabbare återhämtning, och 3) Fastställande av huruvida formen på quantal strömmar som uppstår stimulerande phasic terminaler är att ändras under induktion av depression att ta itu med pre-och postsynaptiska komponenter i synaptisk depression. Detta NMJ är viktigt för pågående forskning och framtida utredare eftersom det ger oss möjlighet att få relevant information som behandlar underhuggare mekanismer synaptiska prestanda som mäts direkt vid släpp platser. Aktuell forskning på detta område är att informera om modulering av synaptisk depression genom att 5-HT och dynamiken i vesikler pooler. Sådana ämnen avser de grundläggande grunderna i synaptisk transmission relevanta för alla neurala system.

<ol><li> Kräftor (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co, Raceland, LA., USA. </li><li> Standard kräftor saltlösning: <ul><li> Modifierad från Van Harreveld lösning (1936). (I mm) 205 NaCl, 5,3 KCl, 13,5 CaCl 2 2H 2 O, 2,45 MgCl 2 6H 2 O, 5 HEPES och justeras till pH 7,4 </li></ul></li><li> Dissection verktyg: Fine # 5 pincett, fina saxar, knivblad hållare, # 26.002-20 insekt stift (alla från Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94.404 till 1139) </li><li> Sylgard belagda dissektion fat, en inspelning maträtt konstrueras antingen med sug elektrod eller använda en sug elektrod och anther manipulator att hålla ett sug elektrod. </li><li> Analysera mikroskop med zoomfunktion för intracellulära inspelningar. För fokus inspelning på visualiseras terminaler ett sammansatt mikroskop med upprätt mål (4 x och 20x) används. Man behöver en Hg ljuskälla. </li><li> Standard intracellulära förstärkare och A / D-styrelsen för on line inspelning till en dator. Elektriska signaler spelas in på linjen till ett PowerLab/4s gränssnitt (ADInstruments, Australien). Vi använder standard programvara från ADInstruments heter diagram eller omfattning. </li><li> Kemikalier: <ul><li> Vi använder en viktig fluorescerande färg, 4 [4 (dietylamino) styryl] N methylpyridinium jodid (4 Di 2 Asp, molekylära sonder, Eugene, OR), för att visualisera varicosities (Marigassi et al, 1987;. Cooper et al, 1995a. ). Alla saltlösning kemikalier som erhölls från Sigma Chemical Company (St. Louis). </li></ul></li><li> För intracellulära inspelningar använder vi glas kapillär slang (katalog # 30-31-0 från FHC, Brunswick, ME, 04.011, USA) och för centrala macropatch elektroder använder vi Kimax-51, Kimble Produkter Art. Nej 34.502, ID 0.8-1,1 mm, längd 100 mm. Den intracellulära elektrod bör ha ett motstånd på 20 till 30 Mohm. Den macropatch elektroden är konstruerad genom att avbryta toppen av glaset efter en fin spets gjordes från en elektrod avdragare. Den avbrutna spetsen måste vara en ren vinkelrät paus om 20 mikroM i diameter. Tipset är värme sedan poleras till ca 10μM innerdiameter. Axeln av elektroden är sedan köra över ett värmeelement för att få den att böja ca 45 grader med en gradvis böj. Detta ger ett platt eller vinkelrätt elektrod lumen över nervändsluten som vinkeln med mikro-manipulator kommer att producera ca ytterligare 45 grader med förberedelserna. </li></ol>

physiological recordings of high and low output nmjs on the crayfish leg extensor muscle

Vi förklarar i detalj hur man exponera och genomföra elektrofysiologiska inspelningar av synaptiska svar för hög (phasic) och låg (tonic) utgång motoriska nervceller innervating extensor muskeln i går benet av en kräftor. Tydliga skillnader finns i fysiologi och morfologi phasic och tonic nervändslut. Den tonic Axon innehåller många fler mitokondrier, som gör det möjligt att ta en viktig fläck mer intensivt än phasic axonet. Den tonic terminaler har varicosities och phasic terminalen är filiform. Den tonic Terminalerna är låga i synaptisk effekt men visar dramatiska underlättas svar. Däremot phasic terminalerna är höga i quantal effekt men visar synaptisk depression med hög frekvens stimulering. Den quantal effekt mäts med en samlingspunkt macropatch elektrod placeras direkt över visualiseras nervändslut. Både phasic och tonic terminaler innerverar samma muskelfibrer, vilket tyder på att inneboende skillnader i nervceller, snarare än differentiell bakåtsträvande feedback från muskel, står för den morfologiska och fysiologiska differentiering.

Watch this Scientific Journal Video about Physiological Recordings of High and Low Output NMJs on the Crayfish Leg Extensor Muscle at JoVE.com

Physiological Recordings of High and Low Output NMJs on the Crayfish Leg Extensor Muscle

Den här artikeln visar hur man genomför elektrofysiologiska inspelningar av synaptiska svar på extensor muskeln i går benet av en kräftor och hur nervändslut visualiseras för att visa de grova morfologiska skillnaderna mellan hög-och låg-utgångsplintar nerv.

Fysiologiska Inspelningar av hög och låg utgång NMJs på Kräftor benböjning Muscle

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Multielectrode Array inspelningar av vomeronasala Epitel

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

State-Dependency Effects on TMS:  A Look at Motive Phosphene Behavior

Statligt Beroende Effekter på TMS: En titt på Motive Phosphene Behavior

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises

Membrane Potentials, Synaptic svar, neurala kretsar, Neuromodulering och Muscle histologi Använda Kräftor: Student Laborationer

The purpose of this report is to help develop an understanding of the effects caused by ion gradients across a biological membrane. Two aspects that ...

Muscle Receptor Organs in the Crayfish Abdomen: A Student Laboratory Exercise in Proprioception

Muscle Receptor organ i Kräftor Buk: En student laboration i Proprioception

The primary purpose of this experiment is to demonstrate primary sensory neurons conveying information of joint movements and positions as proprioceptive ...

Physiological Experimentation with the Crayfish Hindgut: A Student Laboratory Exercise

Fysiologiska experiment med Kräftor hindgut: En student laboration

The purpose of the report is to describe dissection techniques for preparing the crayfish hindgut and to demonstrate how to make physiological recordings ...

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Kopplade Patch Clamp Inspelningar från Motor-neuron och Target skelettmuskulaturen i Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

High-density EEG Recordings of the Freely Moving Mice using Polyimide-based Microelectrode

Hög densitet EEG inspelningar av fritt rörliga Möss med Polyimid-baserade mikroelektrod

Electroencephalogram (EEG) indicates the averaged electrical activity of the neuronal populations on a large-scale level. It is widely utilized as a ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

Multi-elektrod Array Inspelningar av neuronala laviner i Organotypic kulturer

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

Ett förfarande för Implantation Organized arrayer av Microwires för Single-enhet Inspelningar i Awake, uppför djur

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern

Den Swimmeret systemet Kräftor: En praktisk guide för Dissekering av Nerve Cord och extracellulära Inspelningar av Motor Mönster

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of ...