Name: determination of dna methylation of imprinted genes in arabidopsis endosperm
Uploaded: 2011-01-28T18:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm at JoVE.com

De auteurs danken mevrouw Jennifer M. Lommel en Tara N. Rognan voor het onderhoud van Arabidopsis-planten. Dit werk werd ondersteund door start-up fondsen van Saint Louis University en de National Institutes of Health beurzen 1R15GM086846-01 en 3R15GM086846-01S1 aan W. Xiao.

I. Genetische Crossing 1. Emasculating de vrouwelijke ouder Met het oog op de moederlijke en vaderlijke allelen onderscheiden door gebruik te maken DNA-sequentie polymorfisme, twee verschillende ecotypes, bijvoorbeeld Columbia-0 (Col-0) en Ler, zal worden gekozen als vrouwelijke en mannelijke ouders. De planten moeten jong en gezond. Men kan ontmannen de vrouwelijke ouder met behulp van een dissectiemicroscoop, vergrootglas vizier, of blote oog. Zoek stage-12 bloemen ...

<ol>
	<li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines.">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li><li>Cokus, S. J., Feng, S., Zhang, X., Chen, Z., Merriman, B., Haudenschild, C. D., Sriharsa Pradhan, S., Nelson, S. F., Pellegrini, M., Jacobsen, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+bisulphite+sequencing+of+the+Arabidopsis+genome+reveals+DNA+methylation+patterning.">Shotgun bisulphite sequencing of the Arabidopsis genome reveals DNA methylation patterning.</a> Nature. 452, 215-219 (2008).</li><li>Frommer, M., McDonald, L. E., Millar, D. S., Collis, C. M., Watt, F., Grigg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands.">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 89, 1827-1831 (1992).</li><li>Gehring, M., Huh, J. H., Hsieh, T. F., Penterman, J., Choi, Y., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Fischer, R. L. D. E. M. E. T. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+glycosylase+establishes+MEDEA+polycomb+gene+self-imprinting+by+allele-specific+demethylation.">DNA glycosylase establishes MEDEA polycomb gene self-imprinting by allele-specific demethylation.</a> Cell. 124, 495-506 (2006).</li><li>Henderson, I. R., Chan, S. R., Cao, X., Johnson, L., Jacobsen, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+sodium+bisulfite+sequencing+in+plants.">Accurate sodium bisulfite sequencing in plants.</a> Epigenetics. 5, 47-49 (2010).</li><li>Hsieh, T. F., Ibarra, C. A., Silva, P., Zemach, A., Eshed-Williams, L., Fischer, R. L., Zilberman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+demethylation+of+Arabidopsis+endosperm.">Genome-wide demethylation of Arabidopsis endosperm.</a> Science. 324, 1451-1454 (2009).</li><li>Jacobsen, S. E., Sakai, H., Finnegan, E. J., Cao, X., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+hypermethylation+of+flower-specific+genes+in+Arabidopsis.">Ectopic hypermethylation of flower-specific genes in Arabidopsis.</a> Curr. Biol. 10, 179-186 (2000).</li><li>Kinoshita, T., Miura, A., Choi, Y., Kinoshita, Y., Cao, X., Jacobsen, S. E., Fischer, R. L., Kakutani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-way+control+of+FWA+imprinting+in+Arabidopsis+endosperm+by+DNA+methylation.">One-way control of FWA imprinting in Arabidopsis endosperm by DNA methylation.</a> Science. 303, 521-523 (2004).</li><li>Lister, R., O'Malley, R. C., Tonti-Filippini, J., Gregory, B. D., Berry, C. C., Millar, A. H., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+integrated+single-base+resolution+maps+of+the+epigenome+in+Arabidopsis.">Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis.</a> Cell. 133, 523-536 (2008).</li><li>Lister, R., Pelizzola, M., Dowen, R. H., Hawkins, R. D., Hon, G., Tonti-Filippini, J., Nery, J. R., Lee, L., Ye, Z., Ngo, Q. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+DNA+methylomes+at+base+resolution+show+widespread+epigenomic+differences.">Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences.</a> Nature. 462, 315-322 (2009).</li><li>Paulin, R., Grigg, G. W., Davey, M. W., Piper, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urea+improves+efficiency+of+bisulfite-mediated+sequencing+of+5'-+methylcytosine+in+genomic+DNA.">Urea improves efficiency of bisulfite-mediated sequencing of 5'- methylcytosine in genomic DNA.</a> Nucl. Acids Res. 26, 5009-5010 (1998).</li><li>Rogers, S. O., &amp;amp, B. e. n. d. i. c. h., J, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+DNA+from+plant+tissues.">Extraction of DNA from plant tissues.</a> Plant Molecular Biology Manual. A6, 1-10 (1988).</li><li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Elliot, M., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Flower+Development+in+Arab&#237;dopsis.">Early Flower Development in Arab&#237;dopsis.</a> Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li><li>Xiao, W., Gehring, M., Choi, Y., Margossian, L., Pu, H., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Pennell, R. I., Fischer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imprinting+of+the+MEA+Polycomb+gene+is+controlled+by+antagonism+between+MET1+methyltransferase+and+DME+glycosylase.">Imprinting of the MEA Polycomb gene is controlled by antagonism between MET1 methyltransferase and DME glycosylase.</a> Dev. Cell. 5, 891-901 (2003).</li></ol>

Het is relatief eenvoudig om embryo&#39;s te scheiden van het endosperm en de zaadhuid, maar het is vervelend om endosperm scheiden van zaadhuid, vooral voor zaden in een vroeg of midden-torpedo stadium van de embryogenese. Omdat zaadhuid alleen bij een zeer kleine hoeveelheid weefsel, voor sommige genen, bijvoorbeeld, MEA en de FWA, hoeven we niet te endosperm scheiden van zaadhuid. Dat betekent dat we kunnen isoleren RNA&#39;s uit een mengsel van endosperm en zaadhuid weefsels, controleer dan de expr...

Supplies <ul><li> Ontleden Microscoop </li><li> Schaar </li><li> Fijn Tip Forceps </li><li> Sieraden Tag </li><li> Plant Stakes </li><li> String of Twist-Stropdassen </li><li> 4 &quot;X 2&quot; x 8 &quot;polyethyleen zakken </li><li> 3 &quot;X een&quot; X 1,0 mm Microscope Slides </li><li> Vloeibare stikstof </li><li> Containers met vloeibare stikstof </li><li> Warmte Block </li><li> PCR-buisjes </li><li> Thermocycler </li><li> Reactievaatjes </li><li> Microcentrifuge </li><li> Gel Elektroforese faciliteit </li><li> Arabidopsis thaliana Columbia-0 Planten </li><li> Arabidopsis thaliana Landsberg erecta Planten </li></ul> Reagentia <ul><li> Ethanol 70% </li><li> 95% Ethanol </li><li> 100% ethanol </li><li> 0,3 M Sorbitol en 5 mM MES-pH 5,7 </li><li> Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) </li><li> 100% ethanol </li><li> Cholorform </li><li> Restrictie-enzymen </li><li> 3 M NaOH </li><li> 6,3 M NaOH </li><li> 6,24 M Ureum / 4 M natriumbisulfiet </li><li> Steriel gedestilleerd H 2 O </li><li> 10 mM hydrochinon </li><li> Wizard DNA Clean-Up System (Promega) </li><li> 10 M NH 4 OAc </li><li> 20 ug / ul tRNA </li><li> TE-buffer </li><li> De TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) </li></ul>

determination of dna methylation of imprinted genes in arabidopsis endosperm

Arabidopsis thaliana is een uitstekend modelorganisme voor het bestuderen van epigenetische mechanismen. Een van de redenen is het verlies-van-functie null mutant van DNA-methyl-levensvatbaar is, en zo een systeem om te bestuderen hoe het verlies van DNA-methylatie in een genoom van invloed op de groei en ontwikkeling. Imprinting verwijst naar de differentiële expressie van de moederlijke en vaderlijke allelen en speelt een belangrijke rol bij de voortplanting ontwikkeling in zowel zoogdieren en planten. DNA-methylatie is van cruciaal belang voor het bepalen van de vraag of de moeders-of vaderskant allelen van een gen ingeprent is uitgedrukt of het zwijgen opgelegd. In bloeiende planten, is er een dubbele bevruchting gebeurtenis in de voortplanting: een zaadcel bevrucht de eicel naar embryo en een tweede zaadcel zekeringen formulier met de centrale cel aanleiding kan geven tot endosperm. Endosperm is het weefsel waar de inprenting voorkomt in planten. MEDEA, een SET-domeinnaam Polycomb groep gen, en FWA, een transcriptiefactor regulerende bloei, zijn de eerste twee genen aangetoond dat bedrukt in endosperm en hun expressie wordt gecontroleerd door DNA-methylering en demethylering in planten. Met het oog op imprinting status van een gen en methylatie patroon in endosperm te bepalen, moeten we in staat zijn om eerst te isoleren endosperm. Omdat zaad is klein in Arabidopsis, blijft het een uitdaging om Arabidopsis endosperm isoleren en de methylatie te onderzoeken. In deze video protocol, rapporteren we hoe een genetische kruis te voeren, om endosperm weefsel te isoleren uit zaden, en naar de methylatiestatus bepalen bisulfiet sequencing.

Watch this Scientific Journal Video about Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm at JoVE.com

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is een fenomeen in plant en zoogdier reproductie. DNA-methylatie speelt een belangrijke rol in de mechanismen van imprinting. Isoleren endosperm en het bepalen van methylatie status van de ingeprente genen in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Kan moeilijk zijn. In dit protocol beschrijven we hoe de endosperm isoleren en te bepalen door de methylatie bisulfiet sequencing.

Bepaling van de DNA-methylatie van genen in Imprinted Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

Research

JoVE Journal

Biology

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

DNA-methylatie: bisulfiet Wijziging en Analyse

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Chromosomics: Detectie van numerieke en structurele veranderingen in alle 24 menselijke chromosomen tegelijk met behulp van een roman OctoChrome FISH-test

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

Een zaadhuid Bedding Assay om Genetisch Explore<em&gt; In Vitro</em&gt; Hoe de Endosperm Controls zaadontkieming in<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Real-time beeldvorming van Single Engineered RNA-transcripten in levende cellen door gebruik Ratiometrische Bimoleculaire Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

In vitro Methylatietest Assay om Protein Arginine methylatie Bestudeer

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

Verbeterde Verminderde Vertegenwoordiging bisulfietsequencing voor de Beoordeling van DNA-methylatie bij Base Pair Resolutie

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

Correleren Gen-specifieke DNA-methylatie Wijzigingen met Expression en transcriptionele activiteit van de astrocyten<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Gerichte DNA methylatie analyse van next-generation sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatine immunoprecipitatie assay voor de identificatie van Arabidopsis eiwit-DNA interacties<em&gt; In Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Hoge resolutie Kwantificering van kristallijne cellulose accumulatie in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots aan Tissue-specifieke celwand Wijzigingen Monitor

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...