Name: determination of dna methylation of imprinted genes in arabidopsis endosperm
Uploaded: 2011-01-28T18:00:00
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Los autores agradecen a la Sra. Jennifer M. Lommel y Tara N. Rognan para el mantenimiento de plantas de Arabidopsis. Este trabajo fue apoyado por la puesta en marcha de fondos de la Universidad de Saint Louis y los Institutos Nacionales de Salud subvenciones 1R15GM086846-01 y 3R15GM086846-01S1 a W. Xiao.

I. genética Cruce 1. Castrando el progenitor femenino Con el fin de distinguir los alelos maternos y paternos mediante el uso de polimorfismo de secuencia de ADN, dos ecotipos diferentes, por ejemplo, Columbia-0 (Col-0) y Ler, será elegido como padres de familia femenino y masculino. Las plantas deben ser joven y saludable. Se puede castrar el progenitor femenino mediante el uso de un microscopio de disección, de aumento visor, o el ojo desnudo. Localizar 12 etapa ...

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	<li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines.">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li><li>Cokus, S. J., Feng, S., Zhang, X., Chen, Z., Merriman, B., Haudenschild, C. D., Sriharsa Pradhan, S., Nelson, S. F., Pellegrini, M., Jacobsen, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+bisulphite+sequencing+of+the+Arabidopsis+genome+reveals+DNA+methylation+patterning.">Shotgun bisulphite sequencing of the Arabidopsis genome reveals DNA methylation patterning.</a> Nature. 452, 215-219 (2008).</li><li>Frommer, M., McDonald, L. E., Millar, D. S., Collis, C. M., Watt, F., Grigg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands.">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 89, 1827-1831 (1992).</li><li>Gehring, M., Huh, J. H., Hsieh, T. F., Penterman, J., Choi, Y., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Fischer, R. L. D. E. M. E. T. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+glycosylase+establishes+MEDEA+polycomb+gene+self-imprinting+by+allele-specific+demethylation.">DNA glycosylase establishes MEDEA polycomb gene self-imprinting by allele-specific demethylation.</a> Cell. 124, 495-506 (2006).</li><li>Henderson, I. R., Chan, S. R., Cao, X., Johnson, L., Jacobsen, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+sodium+bisulfite+sequencing+in+plants.">Accurate sodium bisulfite sequencing in plants.</a> Epigenetics. 5, 47-49 (2010).</li><li>Hsieh, T. F., Ibarra, C. A., Silva, P., Zemach, A., Eshed-Williams, L., Fischer, R. L., Zilberman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+demethylation+of+Arabidopsis+endosperm.">Genome-wide demethylation of Arabidopsis endosperm.</a> Science. 324, 1451-1454 (2009).</li><li>Jacobsen, S. E., Sakai, H., Finnegan, E. J., Cao, X., Meyerowitz, E. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Flower+Development+in+Arab&#237;dopsis.">Early Flower Development in Arab&#237;dopsis.</a> Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li><li>Xiao, W., Gehring, M., Choi, Y., Margossian, L., Pu, H., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Pennell, R. I., Fischer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imprinting+of+the+MEA+Polycomb+gene+is+controlled+by+antagonism+between+MET1+methyltransferase+and+DME+glycosylase.">Imprinting of the MEA Polycomb gene is controlled by antagonism between MET1 methyltransferase and DME glycosylase.</a> Dev. Cell. 5, 891-901 (2003).</li></ol>

Es relativamente fácil de separar del embrión y endospermo cubierta de la semilla, pero es tedioso para separar el endospermo de la cáscara de la semilla, especialmente para las semillas en la etapa de principios o mediados de torpedo de la embriogénesis. Desde cubierta de la semilla sólo aporta una pequeña cantidad de tejido, para algunos genes, por ejemplo, MEA y FWA, no hay que separar el endospermo de la cáscara de la semilla. Esto significa que podemos aislar ARN a partir de una mezcla de e...

Suministros <ul><li> Microscopio de disección </li><li> Tijeras </li><li> Pinzas de punta fina </li><li> Joyas de la etiqueta </li><li> Las estacas de plantas </li><li> Cuerdas o cintas de cierre </li><li> 4 &quot;X 2&quot; X 8 &quot;Bolsas de Polietileno </li><li> 3 &quot;x 1&quot; x 1.0 mm Micropreparados </li><li> El nitrógeno líquido </li><li> Los contenedores de nitrógeno líquido </li><li> Bloquear el calor </li><li> Tubos para PCR </li><li> Termociclador </li><li> Tubos de microcentrífuga </li><li> Microcentrífuga </li><li> Gel de electroforesis de instalación </li><li> Arabidopsis thaliana Columbia-0 plantas </li><li> Arabidopsis thaliana Landsberg erecta plantas </li></ul> Reactivos <ul><li> 70% de etanol </li><li> Etanol al 95% </li><li> 100% de etanol </li><li> 0,3 M sorbitol y 5 mM MES, pH 5,7 </li><li> Bromuro de amonio cetiltrimetil (CTAB) </li><li> 100% de etanol </li><li> Cholorform </li><li> Las enzimas de restricción </li><li> 3 M NaOH </li><li> 6,3 M NaOH </li><li> 6,24 M de urea / 4 bisulfito de sodio M </li><li> Destilada estéril H 2 O </li><li> 10 mM hidroquinona </li><li> Asistente de ADN Clean-Up System (Promega) </li><li> 10 M NH 4 OAc </li><li> 20 mg / l tRNA </li><li> Tampón TE </li><li> El kit de clonación TOPO TA (Invitrogen) </li></ul>

determination of dna methylation of imprinted genes in arabidopsis endosperm

Arabidopsis thaliana es un organismo modelo excelente para estudiar los mecanismos epigenéticos. Una de las razones es el mutante nulo de pérdida de función de ADN metiltransferasa es viable, proporcionando así un sistema para estudiar cómo la pérdida de metilación del ADN en el genoma afecta el crecimiento y desarrollo. La impronta se refiere a la expresión diferencial de los alelos maternos y paternos, y juega un papel importante en el desarrollo de la reproducción, tanto en mamíferos y plantas. Metilación del ADN es fundamental para determinar si los alelos maternos y paternos de un gen impreso se expresa o se silencian. En las plantas con flores, hay un evento de doble fertilización en la reproducción: un espermatozoide fertiliza el óvulo para formar un embrión y el espermatozoide se fusiona con la célula de segundo central para dar lugar a endospermo. Endospermo es el tejido donde se produce en las plantas de impresión. MEDEA, un dominio establecido Polycomb gen del grupo, y la FWA, un factor de transcripción que regulan la floración, son los dos primeros genes demostrado ser impreso en el endospermo y su expresión está controlada por la metilación del ADN y desmetilación en las plantas. Con el fin de determinar el estado de impresión de un gen y el patrón de metilación en el endospermo, tenemos que ser capaces de aislar primero endospermo. Desde la semilla es muy pequeña en Arabidopsis, que sigue siendo un reto para aislar endospermo Arabidopsis y examinar su metilación. En este protocolo de vídeo, se presenta la manera de realizar un cruce genético, para aislar el tejido del endospermo de las semillas, y para determinar el estado de metilación de la secuenciación de bisulfito.

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Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

La impresión es un fenómeno en la planta y reproducción de los mamíferos. Metilación del ADN juega un papel importante en los mecanismos de impresión. Aislar endospermo y determinar el estado de metilación de los genes impresos en<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Puede ser difícil. En este protocolo, se describe cómo aislar endospermo y determinar la metilación de la secuenciación de bisulfito.

Determinación de la metilación del ADN de los genes impresos en Arabidopsis Endospermo

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

Research

JoVE Journal

Biology

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

La metilación del ADN: Bisulfito de modificación y análisis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Investigación

Biología

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Chromosomics: Detección de alteraciones numéricas y estructurales en todos los 24 cromosomas humanos de manera simultánea utilizando un nuevo ensayo FISH OctoChrome

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

Un Abrigo Ropa de cama de Ensayo de Semillas para explorar Genéticamente<em&gt; In Vitro</em&gt; ¿Cómo la germinación de semillas en Controles Endosperma<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Imágenes en tiempo real de Soltero Engineered ARN transcritos en células vivas utilizando Ratiometric bimoleculares Balizas

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

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In vitro metilación de ensayo para estudiar la proteína arginina metilación

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

Enhanced reducido Representación bisulfito secuenciación para la Evaluación de la metilación del ADN en la Resolución Base Par

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

La correlación de Gene-específica de ADN de metilación cambios con la expresión y actividad transcripcional de astrocíticos<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Dirigida análisis de metilación del ADN mediante secuenciación de próxima generación

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina para la Identificación de Arabidopsis proteína-DNA<em&gt; En Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Alta resolución Cuantificación de celulosa cristalina acumulación en<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Las raíces para monitorear la célula específica de tejido de pared Modificaciones

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...