Name: determination of dna methylation of imprinted genes in arabidopsis endosperm
Uploaded: 2011-01-28T18:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm at JoVE.com

Författarna tackar Ms Jennifer M. Lommel och Tara N. Rognan för underhåll av Arabidopsis växter. Detta arbete stöddes av nystartade fonder från Saint Louis University och National Institutes of Health bidrag 1R15GM086846-01 och 3R15GM086846-01S1 till W. Xiao.

I. Genetiska Crossing 1. Emasculating den kvinnliga föräldern För att särskilja moderns och faderns alleler med hjälp av polymorfism DNA-sekvens, två olika ekotyper, t ex Columbia-0 (Col-0) och Ler, kommer att väljas som kvinnliga respektive manliga föräldrar. Plantorna bör vara unga och friska. Man kan försvaga den kvinnliga föräldern med hjälp av en dissekera mikroskop, förstoringsglas visir eller blotta ögat. Leta stadium-12 blommor (Smyth et al...

<ol>
	<li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines.">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li><li>Cokus, S. J., Feng, S., Zhang, X., Chen, Z., Merriman, B., Haudenschild, C. D., Sriharsa Pradhan, S., Nelson, S. F., Pellegrini, M., Jacobsen, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+bisulphite+sequencing+of+the+Arabidopsis+genome+reveals+DNA+methylation+patterning.">Shotgun bisulphite sequencing of the Arabidopsis genome reveals DNA methylation patterning.</a> Nature. 452, 215-219 (2008).</li><li>Frommer, M., McDonald, L. E., Millar, D. S., Collis, C. M., Watt, F., Grigg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands.">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 89, 1827-1831 (1992).</li><li>Gehring, M., Huh, J. H., Hsieh, T. F., Penterman, J., Choi, Y., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Fischer, R. L. D. E. M. E. T. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+glycosylase+establishes+MEDEA+polycomb+gene+self-imprinting+by+allele-specific+demethylation.">DNA glycosylase establishes MEDEA polycomb gene self-imprinting by allele-specific demethylation.</a> Cell. 124, 495-506 (2006).</li><li>Henderson, I. R., Chan, S. R., Cao, X., Johnson, L., Jacobsen, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+sodium+bisulfite+sequencing+in+plants.">Accurate sodium bisulfite sequencing in plants.</a> Epigenetics. 5, 47-49 (2010).</li><li>Hsieh, T. F., Ibarra, C. A., Silva, P., Zemach, A., Eshed-Williams, L., Fischer, R. L., Zilberman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+demethylation+of+Arabidopsis+endosperm.">Genome-wide demethylation of Arabidopsis endosperm.</a> Science. 324, 1451-1454 (2009).</li><li>Jacobsen, S. E., Sakai, H., Finnegan, E. J., Cao, X., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+hypermethylation+of+flower-specific+genes+in+Arabidopsis.">Ectopic hypermethylation of flower-specific genes in Arabidopsis.</a> Curr. Biol. 10, 179-186 (2000).</li><li>Kinoshita, T., Miura, A., Choi, Y., Kinoshita, Y., Cao, X., Jacobsen, S. E., Fischer, R. L., Kakutani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-way+control+of+FWA+imprinting+in+Arabidopsis+endosperm+by+DNA+methylation.">One-way control of FWA imprinting in Arabidopsis endosperm by DNA methylation.</a> Science. 303, 521-523 (2004).</li><li>Lister, R., O'Malley, R. C., Tonti-Filippini, J., Gregory, B. D., Berry, C. C., Millar, A. H., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+integrated+single-base+resolution+maps+of+the+epigenome+in+Arabidopsis.">Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis.</a> Cell. 133, 523-536 (2008).</li><li>Lister, R., Pelizzola, M., Dowen, R. H., Hawkins, R. D., Hon, G., Tonti-Filippini, J., Nery, J. R., Lee, L., Ye, Z., Ngo, Q. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+DNA+methylomes+at+base+resolution+show+widespread+epigenomic+differences.">Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences.</a> Nature. 462, 315-322 (2009).</li><li>Paulin, R., Grigg, G. W., Davey, M. W., Piper, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urea+improves+efficiency+of+bisulfite-mediated+sequencing+of+5'-+methylcytosine+in+genomic+DNA.">Urea improves efficiency of bisulfite-mediated sequencing of 5'- methylcytosine in genomic DNA.</a> Nucl. Acids Res. 26, 5009-5010 (1998).</li><li>Rogers, S. O., &amp;amp, B. e. n. d. i. c. h., J, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+DNA+from+plant+tissues.">Extraction of DNA from plant tissues.</a> Plant Molecular Biology Manual. A6, 1-10 (1988).</li><li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Elliot, M., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Flower+Development+in+Arab&#237;dopsis.">Early Flower Development in Arab&#237;dopsis.</a> Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li><li>Xiao, W., Gehring, M., Choi, Y., Margossian, L., Pu, H., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Pennell, R. I., Fischer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imprinting+of+the+MEA+Polycomb+gene+is+controlled+by+antagonism+between+MET1+methyltransferase+and+DME+glycosylase.">Imprinting of the MEA Polycomb gene is controlled by antagonism between MET1 methyltransferase and DME glycosylase.</a> Dev. Cell. 5, 891-901 (2003).</li></ol>

Det är relativt lätt att separera embryo från frövita och utsäde päls, men det är jobbigt att separera frövita från fröskalet, särskilt för utsäde i början eller mitten av torped stadium av fosterutvecklingen. Eftersom fröskalet bara bidrar med en mycket liten mängd vävnad för vissa gener, t ex, MEA och FWA, har vi inte att skilja frövita från frö päls. Det innebär att vi kan isolera RNA från en blandning av frövita och utsäde vävnader päls, kontrollera uttrycket av moderns ...

Förbrukningsmaterial <ul><li> Analysera Mikroskop </li><li> Saxar </li><li> Fin spets Tång </li><li> Smycken Tagg </li><li> Plantera Stakes </li><li> Sträng eller Twist-Slipsar </li><li> 4 &quot;x 2&quot; X 8 &quot;polyetylenpåsar </li><li> 3 &quot;x 1&quot; x 1,0 mm Objektglas </li><li> Flytande kväve </li><li> Flytande kväve Behållare </li><li> Värmeblock </li><li> PCR-rör </li><li> Termocykler </li><li> Mikrocentrifugrör </li><li> Mikrocentrifug </li><li> Gelelektrofores anläggning </li><li> Arabidopsis thaliana Columbia-0 växter </li><li> Arabidopsis thaliana Landsberg erecta Växter </li></ul> Reagenser <ul><li> 70% etanol </li><li> 95% etanol </li><li> 100% etanol </li><li> 0,3 M Sorbitol och 5 mM MES-pH 5,7 </li><li> Cetyltrimethyl Ammonium Bromid (CTAB) </li><li> 100% etanol </li><li> Cholorform </li><li> Restriktionsenzymer </li><li> 3 M NaOH </li><li> 6,3 M NaOH </li><li> 6,24 M urea / 4 M Natrium bisulfite </li><li> Sterilt destillerat H 2 O </li><li> 10 mM Hydrokinon </li><li> Guiden DNA Clean-Up System (Promega) </li><li> 10 M NH 4 Oac </li><li> 20 mikrogram / mikroliter tRNA </li><li> TE buffert </li><li> Den TOPO TA Kloning Kit (Invitrogen) </li></ul>

determination of dna methylation of imprinted genes in arabidopsis endosperm

Arabidopsis thaliana är en utmärkt modell organism för att studera epigenetiska mekanismer. En av anledningarna är förlusten-of-funktion null mutant av DNA-metyltransferaser är livskraftig, vilket ger ett system för att studera hur förlusten av DNA-metylering i arvsmassan påverkar tillväxt och utveckling. Imprinting hänvisar till differentierade uttryck av moderns och faderns alleler och spelar en viktig roll i reproduktionen utveckling i både däggdjur och växter. DNA-metylering är avgörande för att avgöra om moderns eller faderns alleler av en präglad gen uttrycks eller tystas. I blommande växter, finns det en dubbel befruktning händelse i reproduktion: en spermie befruktar ägget att bilda embryot och en andra säkringar spermier med den centrala cellen för att ge upphov till frövita. Frövitan är vävnaden där imprinting förekommer i växter. Medea, en SET-domän Polycomb grupp gen, och FWA, en transkriptionsfaktor som reglerar blomning, är de första två gener visat sig vara inpräntad i frövita och deras uttryck styrs av DNA-metylering och demetylering i växter. För att avgöra imprinting status för en gen och metylering mönster i frövita, måste vi kunna isolera frövitan först. Eftersom frö är liten i Arabidopsis, är det svårt att isolera Arabidopsis frövita och undersöka dess metylering. I den här videon protokoll, rapporterar vi hur man genomför en genetisk kors, för att isolera frövitan vävnad från frön, och att fastställa den metylering status genom bisulfite sekvensering.

Watch this Scientific Journal Video about Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm at JoVE.com

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting är ett fenomen i anläggningar och däggdjur reproduktion. DNA-metylering spelar en viktig roll för mekanismer för prägling. Isolera frövita och bestämma metylering status präglade gener i<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Kan vara svårt. I detta protokoll beskriver vi hur du kan isolera frövita och bestämma metylering av bisulfite sekvensering.

Fastställande av DNA-metylering av Präglade Gener i Arabidopsis Frövitan

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

Research

JoVE Journal

Biology

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

DNA-metylering:, dock Ändring och analys

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Chromosomics: Spårning av numeriska och strukturella förändringar i Alla 24 mänskliga kromosomer samtidigt enligt en ny OctoChrome FISH analys

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

En Seed Coat Bedding analys till Genetiskt Upptäck<em&gt; In Vitro</em&gt; Hur frövitan Controls frögroning i<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Realtid avbildning av Single Engineered RNA transkript hos levande celler Använda Propportionell bimolekylär Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

In vitro Metylering analys för att studera protein Arginin Metylering

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

Förstärkt Minskad Representation bisulfit sekvense för Bedömning av DNA-metylering vid baspar Upplösning

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

Korrelera Genspecifika DNA-metylering Förändringar med uttryck och transkriptionsaktiviteten för astrocytisk<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Riktade DNA-metylering analys av Nästa generations sekvense

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Kromatin Immunoprecipitation analys för identifiering av Arabidopsis Protein-DNA-interaktioner<em&gt; In Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Högupplöst Kvantifiering av kristallin cellulosa Ackumulering i<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots att övervaka Vävnadsspecifik cellvägg Ändringar

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...