Name: the production of c. elegans transgenes via recombineering with the galk selectable marker
Uploaded: 2011-01-11T23:58:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker at JoVE.com

فإن الكتاب أود أن أشكر ليندسي ناش للمساعدة في تطوير هذه التقنية. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح AG028977 لمؤسسة آنا ليند ، منحة المشروع التجريبي من جامعة بيتسبرغ OAIC (AG024827) ، وصناديق البذور من جامعة بيتسبرغ.

نظرة عامة العديد من الجينات المحورة المستخدمة في توليد جيم المعدلة وراثيا ايليجانس تتألف من تسلسل المروج وربما الجينات [كدنا] المستنسخة في واحدة من الناقلات التي تم إنشاؤها بواسطة مختبر الدكتور اندي الحريق 1. في حي...

<ol>
	<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transformation.">DNA transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).</li><li>Zhang, Y., Nash, L., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified,+robust,+and+streamlined+procedure+for+the+production+of+C.+elegans+transgenes+via+recombineering.">A simplified, robust, and streamlined procedure for the production of C. elegans transgenes via recombineering.</a> BMC Dev Biol. 8, 119-119 (2008).</li><li>Antebi, A., Yeh, W. H., Tait, D., Hedgecock, E. M., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daf-12+encodes+a+nuclear+receptor+that+regulates+the+dauer+diapause+and+developmental+age+in+C.+elegans.">daf-12 encodes a nuclear receptor that regulates the dauer diapause and developmental age in C. elegans.</a> Genes and Development. 14, 1512-1527 (2000).</li><li>Snow, M. I., Larsen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+expression+of+daf-12:+a+nuclear+hormone+receptor+with+three+isoforms+that+are+involved+in+development+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Structure and expression of daf-12: a nuclear hormone receptor with three isoforms that are involved in development and aging in Caenorhabditis elegans.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1494, 104-116 (2000).</li><li>Fisher, A. L., Page, K. E., Lithgow, G. J., Nash, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+K10C2.4+Gene+Encodes+a+Member+of+the+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Family.+A+CAENORHABDITIS+ELEGANS+MODEL+OF+TYPE+I+TYROSINEMIA.">The Caenorhabditis elegans K10C2.4 Gene Encodes a Member of the Fumarylacetoacetate Hydrolase Family. A CAENORHABDITIS ELEGANS MODEL OF TYPE I TYROSINEMIA.</a> J Biol.Chem. 283, 9127-9135 (2008).</li><li>Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+regulation+of+the+heterochronic+gene+lin-14+by+lin-4+mediates+temporal+pattern+formation+in+C.+elegans.">Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans.</a> Cell. 75, 855-862 (1993).</li><li>Lehrbach, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIN-28+and+the+poly(U)+polymerase+PUP-2+regulate+let-7+microRNA+processing+in+Caenorhabditis+elegans.">LIN-28 and the poly(U) polymerase PUP-2 regulate let-7 microRNA processing in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Struct Mol Biol. 16, 1016-1020 (2009).</li><li>Tursun, B., Cochella, L., Carrera, I., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolkit+and+robust+pipeline+for+the+generation+of+fosmid-based+reporter+genes+in+C.+elegans.">A toolkit and robust pipeline for the generation of fosmid-based reporter genes in C. elegans.</a> PLoS One. 4, e4625-e4625 (2009).</li><li>Bamps, S., Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+gene+expression+pattern+analysis,+in+situ,+in+Caenorhabditis+elegans.">Large-scale gene expression pattern analysis, in situ, in Caenorhabditis elegans.</a> Brief. Funct. Genomic. Proteomic. , (2008).</li><li>Dolphin, C. T., Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+reporter+fusion+genes+generated+by+seamless+modification+of+large+genomic+DNA+clones.">Caenorhabditis elegans reporter fusion genes generated by seamless modification of large genomic DNA clones.</a> Nucleic Acids Res. 34, e72-e72 (2006).</li><li>Sarov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombineering+pipeline+for+functional+genomics+applied+to+Caenorhabditis+elegans.">A recombineering pipeline for functional genomics applied to Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Methods. 3, 839-844 (2006).</li><li>Yang, X. W., Model, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+based+modification+in+Escherichia+coli+and+germline+transmission+in+transgenic+mice+of+a+bacterial+artificial+chromosome.">Homologous recombination based modification in Escherichia coli and germline transmission in transgenic mice of a bacterial artificial chromosome.</a> Nat Biotechnol. 15, 859-865 (1997).</li><li>Court, D. L., Sawitzke, J. A., Thomason, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+using+homologous+recombination.">Genetic engineering using homologous recombination.</a> Annu.Rev.Genet. 36, 361-388 (2002).</li><li>Westenberg, M., Bamps, S., Soedling, H., Hope, I. A., Dolphin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+MW005:+lambda+Red-mediated+recombineering+and+copy-number+induction+of+oriV-equipped+constructs+in+a+single+host.">Escherichia coli MW005: lambda Red-mediated recombineering and copy-number induction of oriV-equipped constructs in a single host.</a> BMC Biotechnol. 10, 27-27 (2010).</li><li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection.">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Res. 33, e36-e36 (2005).</li><li>Penfold, R. J., Pemberton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+suicide+vector+for+construction+of+chromosomal+insertion+mutations+in+bacteria.">An improved suicide vector for construction of chromosomal insertion mutations in bacteria.</a> Gene. 118, 145-146 (1992).</li><li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans.">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li><li>Puig, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tandem+affinity+purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li><li>Rigaut, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat.Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).</li><li>Achilleos, A., Wehman, A. M., Nance, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAR-3+mediates+the+initial+clustering+and+apical+localization+of+junction+and+polarity+proteins+during+C.+elegans+intestinal+epithelial+cell+polarization.">PAR-3 mediates the initial clustering and apical localization of junction and polarity proteins during C. elegans intestinal epithelial cell polarization.</a> Development. 137, 1833-1842 (2010).</li><li>Maduro, M., Pilgrim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+cloning+of+unc-119,+a+gene+expressed+in+the+Caenorhabditis+elegans+nervous+system.">Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system.</a> Genetics. 141, 977-988 (1995).</li></ol>

توليد الجينات المحورة من fosmids يقدم فائدة الاحتفاظ بجميع العناصر المروج الأصلي ، متغيرات لصق ، و 3 &quot;العناصر UTR التنظيمية. وهذا يمكن أن يؤدي إلى بناء التحوير الذي هو أكثر تعبيرا عن نمط التعبير الأصلي ، أو بناء على التحوير وظيفية عندما تفشل الأساليب الأخرى 5. يمكن ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>FosmidMAX kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Epicentre</td>
<td>FMAX046</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GoTaq</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>M7122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MOPS Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Teknova</td>
<td>M2120</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.132 M Potassium phosphate solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Teknova</td>
<td>M2102</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-galactose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G0750</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2-deoxygalactose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D4407</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>B4639</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leucine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L8000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NH4Cl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9434</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phusion DNA polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB</td>
<td>F-530S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MacConkey agar base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>281810</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Arabinose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A3131</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chloramphenicol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C1919</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium phosphate dibasic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S5136</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium phosphate monobasic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P5655</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S5886</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G2025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bacto Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>214010</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

the production of c. elegans transgenes via recombineering with the galk selectable marker

ويستخدم على نطاق واسع خلق الحيوانات المعدلة وراثيا في C. ايليجانس البحوث بما في ذلك استخدام البروتينات الانصهار GFP لدراسة نمط التنظيم والتعبير عن الجينات في المصالح أو جيل من تنقية تقارب جنبا إلى جنب (وات) الموسومة إصدارات جينات محددة لتسهيل تنقية بهم. عادة يتم إنشاؤها الجينات المحورة من خلال وضع مروج المنبع من الجين مراسل GFP [كدنا] أو المصالح ، وهذا غالبا ما ينتج عن نمط التعبير التمثيلي. ومع ذلك ، والعناصر الحاسمة لتنظيم الجينات ، مثل عناصر المراقبة في المنطقة 3 &#39;غير مترجمة أو المروجين بديلة ، يمكن أن غاب عن هذا النهج. كذلك يمكن إلا أن يكون متغير واحد درس عادة لصق هذه الوسائل. في المقابل ، فإن استخدام الحمض النووي الجيني الدودة التي يحملها استنساخ الحمض النووي fosmid يتضمن على الأرجح إن لم يكن كل العناصر المتورطة في تنظيم الجينات في الجسم الحي الذي يسمح للمزيد من القدرة على التقاط نمط التعبير الحقيقي والتوقيت. لتسهيل توليد الجينات المحورة باستخدام الحمض النووي fosmid ، ونحن تصف E. القولونية يستند الإجراء recombineering لادخال GFP ، حنفية ، العلامة ، أو سلاسل أخرى ذات اهتمام في أي مكان في الجينات. يستخدم الإجراء الجين كما galK علامة الاختيار لكلا من اختيار الخطوات الإيجابية والسلبية في النتائج التي recombineering في الحصول على التعديل المطلوب بكفاءة عالية. مزيد من البلازميدات تحتوي على الجين galK محاط الأسلحة إلى التماثل GFP يشيع استخدامها والاستفادة من الجينات الانصهار متوفرة مما يقلل من تكلفة oligos بنسبة 50 ٪ عند توليد البروتين GFP أو TAP الانصهار. هذه البلازميدات استخدام النسخ الأصلية R6K ما يحول دون الحاجة إلى واسعة لتنقية المنتج PCR. أخيرا ، علينا أن نظهر أيضا تقنية لدمج علامة UNC - 119 إلى العمود الفقري fosmid الذي يسمح للfosmid حقنه مباشرة أو المقصوفة الديدان لتوليد حيوانات معدلة وراثيا. هذا الفيديو يوضح الإجراءات التي ينطوي عليها توليد التحوير عبر recombineering باستخدام هذا الأسلوب.

Watch this Scientific Journal Video about The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker at JoVE.com

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

القدرة على إنتاج لالجينات المحورة<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; الجينومية باستخدام الحمض النووي التي يحملها fosmids على جاذبية خاصة حيث يتم الاحتفاظ بكافة العناصر التنظيمية المحلية. ووصف هو إجراء بسيط وفعال للانتاج عن طريق الجينات المحورة مع recombineering<em&gt; galK</em&gt; علامة اختيار.

لإنتاج C. ايليجانس الجينات المحورة عبر Recombineering مع galK إختيار ماركر

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

توليد مستقرة ايليجانس جيم المعدلة وراثيا عن طريق Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

تطبيق الفحص جيم ايليجانس الدوبامين العصبية للتحلل من التحقق من صحة جينات مرض باركنسون المحتملة

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

تشريح والتسجيل من مفرق العضلية جيم ايليجانس

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer

بروتوكول لإنتاج Tetramer KLRG1

Killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1) is a type II transmembrane glycoprotein inhibitory receptor belonging to the C type lectin-like superfamily. ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

قياس انواع معينة ايليجانس الحياة سبان في 96 لوحات Microtiter حسنا

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

الفرز الفائق الإنتاجية وBiosensing مع نيون C. ايليجانس سلالات

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

خلق بيئات الغازية محددة لدراسة تأثير نقص الأكسجة في<em&gt; C. ايليجانس</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

باستخدام الحمض النووي الريبي التي تتوسط استراتيجية التغذية التدخل للكشف عن الجينات المسؤولة عن تنظيم حجم الجسم في نيماتودا<em&gt; C. ايليجانس</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

C. ايليجانس الانجذاب الكيميائي الفحص

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that ...