Name: the production of c. elegans transgenes via recombineering with the galk selectable marker
Uploaded: 2011-01-11T23:58:00
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लेखकों Lindsey नैश के लिए तकनीक विकसित करने के साथ मदद के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम NIH अनुदान AG028977 द्वारा ALF, पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय से एक पायलट और पिट्सबर्ग OAIC विश्वविद्यालय (AG024827), और बीज धन से परियोजना अनुदान के लिए वित्त पोषित किया गया था.

अवलोकन कई ट्रांसजेनिक सी. की पीढ़ी में इस्तेमाल किया transgenes एलिगेंस प्रमोटर दृश्यों से मिलकर बनता है और शायद एक सीडीएनए जीन डॉ. एंडी 1 आग की प्रयोगशाला द्वारा उत्पन्न वैक्टर में क्लो?...

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	<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transformation.">DNA transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).</li><li>Zhang, Y., Nash, L., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified,+robust,+and+streamlined+procedure+for+the+production+of+C.+elegans+transgenes+via+recombineering.">A simplified, robust, and streamlined procedure for the production of C. elegans transgenes via recombineering.</a> BMC Dev Biol. 8, 119-119 (2008).</li><li>Antebi, A., Yeh, W. H., Tait, D., Hedgecock, E. M., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daf-12+encodes+a+nuclear+receptor+that+regulates+the+dauer+diapause+and+developmental+age+in+C.+elegans.">daf-12 encodes a nuclear receptor that regulates the dauer diapause and developmental age in C. elegans.</a> Genes and Development. 14, 1512-1527 (2000).</li><li>Snow, M. I., Larsen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+expression+of+daf-12:+a+nuclear+hormone+receptor+with+three+isoforms+that+are+involved+in+development+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Structure and expression of daf-12: a nuclear hormone receptor with three isoforms that are involved in development and aging in Caenorhabditis elegans.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1494, 104-116 (2000).</li><li>Fisher, A. L., Page, K. E., Lithgow, G. J., Nash, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+K10C2.4+Gene+Encodes+a+Member+of+the+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Family.+A+CAENORHABDITIS+ELEGANS+MODEL+OF+TYPE+I+TYROSINEMIA.">The Caenorhabditis elegans K10C2.4 Gene Encodes a Member of the Fumarylacetoacetate Hydrolase Family. A CAENORHABDITIS ELEGANS MODEL OF TYPE I TYROSINEMIA.</a> J Biol.Chem. 283, 9127-9135 (2008).</li><li>Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+regulation+of+the+heterochronic+gene+lin-14+by+lin-4+mediates+temporal+pattern+formation+in+C.+elegans.">Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans.</a> Cell. 75, 855-862 (1993).</li><li>Lehrbach, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIN-28+and+the+poly(U)+polymerase+PUP-2+regulate+let-7+microRNA+processing+in+Caenorhabditis+elegans.">LIN-28 and the poly(U) polymerase PUP-2 regulate let-7 microRNA processing in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Struct Mol Biol. 16, 1016-1020 (2009).</li><li>Tursun, B., Cochella, L., Carrera, I., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolkit+and+robust+pipeline+for+the+generation+of+fosmid-based+reporter+genes+in+C.+elegans.">A toolkit and robust pipeline for the generation of fosmid-based reporter genes in C. elegans.</a> PLoS One. 4, e4625-e4625 (2009).</li><li>Bamps, S., Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+gene+expression+pattern+analysis,+in+situ,+in+Caenorhabditis+elegans.">Large-scale gene expression pattern analysis, in situ, in Caenorhabditis elegans.</a> Brief. Funct. Genomic. Proteomic. , (2008).</li><li>Dolphin, C. T., Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+reporter+fusion+genes+generated+by+seamless+modification+of+large+genomic+DNA+clones.">Caenorhabditis elegans reporter fusion genes generated by seamless modification of large genomic DNA clones.</a> Nucleic Acids Res. 34, e72-e72 (2006).</li><li>Sarov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombineering+pipeline+for+functional+genomics+applied+to+Caenorhabditis+elegans.">A recombineering pipeline for functional genomics applied to Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Methods. 3, 839-844 (2006).</li><li>Yang, X. W., Model, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+based+modification+in+Escherichia+coli+and+germline+transmission+in+transgenic+mice+of+a+bacterial+artificial+chromosome.">Homologous recombination based modification in Escherichia coli and germline transmission in transgenic mice of a bacterial artificial chromosome.</a> Nat Biotechnol. 15, 859-865 (1997).</li><li>Court, D. L., Sawitzke, J. A., Thomason, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+using+homologous+recombination.">Genetic engineering using homologous recombination.</a> Annu.Rev.Genet. 36, 361-388 (2002).</li><li>Westenberg, M., Bamps, S., Soedling, H., Hope, I. A., Dolphin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+MW005:+lambda+Red-mediated+recombineering+and+copy-number+induction+of+oriV-equipped+constructs+in+a+single+host.">Escherichia coli MW005: lambda Red-mediated recombineering and copy-number induction of oriV-equipped constructs in a single host.</a> BMC Biotechnol. 10, 27-27 (2010).</li><li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection.">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Res. 33, e36-e36 (2005).</li><li>Penfold, R. J., Pemberton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+suicide+vector+for+construction+of+chromosomal+insertion+mutations+in+bacteria.">An improved suicide vector for construction of chromosomal insertion mutations in bacteria.</a> Gene. 118, 145-146 (1992).</li><li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans.">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li><li>Puig, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tandem+affinity+purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li><li>Rigaut, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat.Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).</li><li>Achilleos, A., Wehman, A. M., Nance, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAR-3+mediates+the+initial+clustering+and+apical+localization+of+junction+and+polarity+proteins+during+C.+elegans+intestinal+epithelial+cell+polarization.">PAR-3 mediates the initial clustering and apical localization of junction and polarity proteins during C. elegans intestinal epithelial cell polarization.</a> Development. 137, 1833-1842 (2010).</li><li>Maduro, M., Pilgrim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+cloning+of+unc-119,+a+gene+expressed+in+the+Caenorhabditis+elegans+nervous+system.">Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system.</a> Genetics. 141, 977-988 (1995).</li></ol>

fosmids से transgenes की पीढ़ी देशी प्रमोटर तत्वों, ब्याह वेरिएंट, और 3 &#39;UTR नियामक तत्वों के सभी बनाए रखने का लाभ प्रदान करता है. यह एक transgene है जो देशी अभिव्यक्ति पैटर्न, या जब अन्य तरीकों 5 असफल एक कार्यात्मक transgene क?...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>FosmidMAX kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Epicentre</td>
<td>FMAX046</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GoTaq</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>M7122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MOPS Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Teknova</td>
<td>M2120</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.132 M Potassium phosphate solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Teknova</td>
<td>M2102</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-galactose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G0750</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2-deoxygalactose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D4407</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>B4639</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leucine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L8000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NH4Cl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9434</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phusion DNA polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB</td>
<td>F-530S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MacConkey agar base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>281810</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Arabinose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A3131</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chloramphenicol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C1919</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium phosphate dibasic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S5136</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium phosphate monobasic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P5655</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S5886</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G2025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bacto Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>214010</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

the production of c. elegans transgenes via recombineering with the galk selectable marker

ट्रांसजेनिक जानवर के निर्माण सी. में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है एलिगेंस अनुसंधान सहित GFP संलयन प्रोटीन का उपयोग करने के विनियमन और ब्याज या अग्रानुक्रम आत्मीयता शुद्धि की पीढ़ी (नल) विशिष्ट जीन की संस्करण उनके शुद्धीकरण की सुविधा के लिए टैग के जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न का अध्ययन . आमतौर पर transgenes एक प्रमोटर एक GFP रिपोर्टर जीन या ब्याज की सीडीएनए के ऊपर रखकर उत्पन्न कर रहे हैं, और इस बार एक प्रतिनिधि अभिव्यक्ति पैटर्न का उत्पादन. हालांकि, 3 &#39;untranslated क्षेत्र या वैकल्पिक प्रमोटरों में नियंत्रण तत्व के रूप में जीन विनियमन के महत्वपूर्ण तत्व, इस दृष्टिकोण से याद किया जा सकता है. इसके अलावा केवल एक एकल ब्याह संस्करण आम तौर पर इस तरह से अध्ययन किया जा सकता है. इसके विपरीत, fosmid डीएनए क्लोन द्वारा किए कीड़ा जीनोमिक डीएनए के उपयोग की संभावना शामिल सबसे जो अधिक से अधिक वास्तविक अभिव्यक्ति पैटर्न और समय पर कब्जा करने की क्षमता परमिट vivo में जीन विनियमन में शामिल सभी तत्वों अगर नहीं. Fosmid डीएनए का उपयोग कर transgenes की पीढ़ी की सुविधा के लिए, हम एक ई. वर्णन कोलाई recombineering GFP, एक नल टैग, या हित के अन्य दृश्यों जीन में किसी भी स्थान में सम्मिलित प्रक्रिया आधारित है. प्रक्रिया चयन मार्कर के रूप में सकारात्मक और नकारात्मक दोनों recombineering में चयन कदम है जो उच्च दक्षता के साथ वांछित संशोधन को प्राप्त करने में परिणाम के लिए galK जीन का उपयोग करता है. इसके अलावा, galK GFP के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया अनुरूपता हथियार द्वारा flanked और जीन नल संलयन जीन युक्त plasmids उपलब्ध है जो 50% से oligos की लागत को कम जब एक GFP या नल संलयन प्रोटीन पैदा कर रहे हैं. ये प्लास्मिड जो व्यापक पीसीआर उत्पाद शुद्धि के लिए जरूरत precludes R6K प्रतिकृति मूल का उपयोग करें. अंत में, हम भी fosmid रीढ़ जो fosmid सीधे इंजेक्शन या कीड़े में बमबारी ट्रांसजेनिक जानवर उत्पन्न की अनुमति देता है पर unc-119 मार्कर को एकीकृत करने के लिए एक तकनीक का प्रदर्शन. यह वीडियो recombineering के माध्यम से इस पद्धति का उपयोग करके एक transgene पैदा करने में शामिल प्रक्रियाओं को दर्शाता है.

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The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

के लिए transgenes उत्पादन करने की क्षमता<em&gt; Caenorhabditis एलिगेंस</em&gt; जीनोमिक fosmids द्वारा किए गए डीएनए का उपयोग विशेष रूप से आकर्षक है के रूप में देशी नियामक तत्वों के सभी को बरकरार रखा हो रहे हैं. साथ recombineering के माध्यम transgenes के उत्पादन के लिए एक सरल और मजबूत प्रक्रिया में वर्णित<em&gt; GalK</em&gt; चयन मार्कर.

का उत्पादन सी. एलिगेंस Recombineering के साथ के माध्यम से transgenes GalK चयन मार्कर

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

स्थिर ट्रांसजेनिक सी. Microinjection का उपयोग एलिगेंस पीढ़ी

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

सी एलिगेंस Dopamine न्यूरॉन अध: पतन परख की संभावित पार्किंसंस रोग जीन की मान्यता के लिए आवेदन

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

सी एलिगेंस Neuromuscular जंक्शन से विदारक और रिकॉर्डिंग

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer

KLRG1 tetramer के उत्पादन के लिए एक प्रोटोकॉल

Killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1) is a type II transmembrane glycoprotein inhibitory receptor belonging to the C type lectin-like superfamily. ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

माप Caenorhabditis एलिगेंस 96 खैर microtiter प्लेट्स में लाइफ स्पैन

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

उच्च throughput और प्रतिदीप्त के साथ स्क्रीनिंग biosensing सी. एलिगेंस खींच

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

निर्धारित गैसीय वातावरण बनाना पर Hypoxia के प्रभाव का अध्ययन<em&gt; सी. एलिगेंस</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

निमेटोड में शारीरिक आकार विनियमन में शामिल जीनों के लिए स्क्रीन के लिए आरएनए की मध्यस्थता हस्तक्षेप दूध पिलाने की रणनीति का प्रयोग कर<em&gt; सी. एलिगेंस</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

एलिगेंस Chemotaxis परख

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that ...