Name: analysis of pluripotent stem cells by using cryosections of embryoid bodies
Uploaded: 2010-12-08T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Pluripotent Stem Cells by using Cryosections of Embryoid Bodies at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von Fundação de Amparo unterstützte eine Fortgeschrittenen-do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) und dem Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia (INCTC). Wir sind dankbar, Bruna S. Paulsen und Aline M. Fernandes für die EB Bilder.

1. Fixation und Kryokonservierung Pluripotenten Stammzellen wurden auf embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) mit Mitomycin C inaktiviert und gepflegt in DMEM/F12 ergänzt mit 20% Knockout Serumersatz (KSR) und 8ng / ml Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF-2) kultiviert. Um EB induzieren H9-Zellen wurden auf nicht-haftenden Schalen überführt und kultiviert für 7 Tage, in DMEM/F12 mit 15% KSR 8 ergänzt gepflegt. Hinweis (!): Diese Technik kann für EBs aus allen embryonale...

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	<li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-117 (1998).</li><li>Itskovitz-Eldor, J., Schuldiner, M., Karsenti, D., Eden, A., Yanuka, O., Amit, M., Soreq, H., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+compromising+the+three+embryonic+germ+layers.">Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers.</a> Mol Med. 6, 88-95 (2000).</li><li>Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+inducing+embryoid+body+formation:+in+vitro+differentiation+system+of+embryonic+stem+cells.">Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells.</a> J Biosci Bioeng. 103, 389-398 (2007).</li><li>Conley, B. J., Young, J. C., Trounson, A. O., Mollard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+propagation+and+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Derivation propagation and differentiation of human embryonic stem cells.</a> Int J Biochem Cell Biol. 36, 555-567 (2004).</li><li>Moon, I. S., Cho, S. J., Jin, I., Walikonis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+combined+fluorescence+in+situ+hybridization+and+immunocytochemistry.">A simple method for combined fluorescence in situ hybridization and immunocytochemistry.</a> Mol Cells. 24, 76-82 (2007).</li><li>Daneshtalab, N., Dor&#233;, J. J., Smeda, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+tissue+specificity+and+antibody+selection:+Procedures+in+immunohistochemical+studies.">Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 61, 127-135 (2009).</li><li>Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-induced+antigen+retrieval+for+immunohistochemical+reactions+in+routinely+processed+paraffin+sections.">Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections.</a> Methods Mol Biol. , 588-5103 (2010).</li><li>Nones, J., Spohr, T. C., Furtado, D. R., Sartore, R. C., Paulsen, B. S., Guimar&#227;es, M. Z., Rehen, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+modulate+cell+survival+in+embryoid+bodies.">Cannabinoids modulate cell survival in embryoid bodies.</a> Cell Biol Int. 12, 399-408 (2010).</li><li>Huang, W. M., Gibson, S. J., Facer, P., Gu, J., Polak, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+section+adhesion+for+immunocytochemistry+using+high+molecular+weight+polymers+of+L-lysine+as+a+slide+coating.">Improved section adhesion for immunocytochemistry using high molecular weight polymers of L-lysine as a slide coating.</a> Histochemistry. 77, 275-279 (1983).</li><li>Kuenzi, M. J., Sherwood, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localization+of+specific+relaxin-binding+cells+in+thecervix,+mammary+glands,+and+nipples+of+pregnant+rats.">Immunohistochemical localization of specific relaxin-binding cells in thecervix, mammary glands, and nipples of pregnant rats.</a> Endocrinology. 136, 1367-1373 (1995).</li></ol>

Die hier beschriebene Methode bietet eine einfach zu folgen Protokoll PFA fixiert dünne Kryostatschnitte von Embryoidkörpern nützlich für Immunfluoreszenz und in situ-Hybridisierung Assays zu erhalten. Die daraus resultierende Kryoschnitten erlauben die Untersuchung von zellulären und molekularen Aspekten der menschlichen embryonalen Stammzellen die Differenzierung unter Wahrung ihrer Struktur und Organisation als Aggregate.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>D (+) Sucrose</td>
<td>Reagent</td>
<td>Vetec</td>
<td>228</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>Reagent</td>
<td>Rieden-de Ha&euml;n</td>
<td>16005</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS solution</td>
<td>Reagent</td>
<td>LGC Biotecnology</td>
<td>13-30259.05</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P2636</td>
<td>200mg/mL in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sakura</td>
<td>P2636</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose Solution</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10% Sucrose Solution in PBS w/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Sucrose Solution</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>20% Sucrose Solution in PBS w/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Sucrose Solution</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>30% Sucrose Solution in PBS w/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Conic Tube</td>
<td>Tool</td>
<td>TPP</td>
<td>91015</td>
<td>15mL conic tube</td>
</tr>
<tr>
<td>Plate shaker</td>
<td>Tool</td>
<td>Biomixer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cryostat</td>
<td>Tool</td>
<td>Leica</td>
<td>CM 1850</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mold for OCT platform</td>
<td>Tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Plastic mold plataform</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

analysis of pluripotent stem cells by using cryosections of embryoid bodies

Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) sind pluripotente Zellen aus der inneren Zellmasse der Blastozyste-Phase Anfang Säugerembryonen 1 abgeleitet. Eine entscheidende Etappe in der Differenzierung von ES-Zellen ist die Bildung von Embryoidkörpern (EVG) Aggregate 2, 3. EB Bildung ist auf spontane Aggregation basiert, wenn ES-Zellen in nicht haftenden Platten kultiviert. Ektoderm, Mesoderm und Endoderm 4: Dreidimensionale EB rekapituliert viele Aspekte der frühen Embryogenese von Säugetieren und in die drei Keimblätter differenzieren. Immunfluoreszenz und in situ-Hybridisierung sind allgemein Techniken für die Detektion von Target-Proteinen und mRNA in Zellen eines Gewebes § 5, 6, 7 verwendet. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache Technik, um qualitativ hochwertige Gefrierschnitte von Embryoidkörpern generieren. Dieser Ansatz stützt sich auf die räumliche Orientierung der EB Einbettung in OCT gefolgt von den Gefrier-Technik. Die daraus resultierenden Abschnitte können auf eine Vielzahl von analytischen Verfahren unterzogen werden, um Populationen von Zellen, die bestimmte Proteine, RNA oder DNA zu charakterisieren. In diesem Sinne sind die Herstellung von EB Kryoschnitten (10 um) wesentliche Instrumente für die Histologie Färbung Analyse (zB Hämatoxilin und Eosin, DAPI), Immunfluoreszenz (zB Oct4, Nestin) oder in-situ-Hybridisierung. Diese Technik kann auch dazu beitragen, Aspekte der Embryogenese in Bezug auf die Aufrechterhaltung des dreidimensionalen sphärischen Struktur des EBs zu verstehen.

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Analysis of Pluripotent Stem Cells by using Cryosections of Embryoid Bodies

Pluripotenten Stammzellen in Suspension wachsende Differenzierung in Embryoidkörpern (EBS). Hier zeigen wir, wie eine hohe Qualität EB Kryoschnitten nützlich für die Untersuchung zellulärer und molekularer Aspekte der Embryogenese zu erhalten, unter Wahrung ihrer Organisation als Aggregate.

Analyse von pluripotenten Stammzellen mit Kryoschnitte von Embryoid Bodies

Embryonic stem (ES) cells are pluripotent cells derived from the inner cell mass of blastocyst-stage early mammalian embryos 1. A crucial stage in the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Shrinky-Dink Hanging Drops: A Simple Way to Form and Culture Embryoid Bodies

Shrinky-Dink hängende Tropfen: Ein einfacher Weg zu Form und Kultur Embryoid Bodies

Embryoid bodies (EB) are aggregates of embryonic stem cells. The most common way of creating these aggregates is the hanging drop method, a laborious ...

Forschung

Biologie

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen durch Reprogrammierung menschlichen Fibroblasten mit dem Stemgent Menschliche TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus

Immunzytochemische Analyse von menschlichen pluripotenten Stammzellen mit Hilfe eines Self-Made Cytospin Apparatus

Human pluripotent stem cells (hPSCs) that include human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are exciting cell ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Transfektion und Nucleofecting menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Reprogrammierung menschlichen Körperzellen in induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) mit retroviralen Vektoren mit GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Generation of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit dem STEMCCA Lentivirusvektor

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

High Efficiency Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen zu Kardiomyozyten und Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...