Name: analysis of pluripotent stem cells by using cryosections of embryoid bodies
Uploaded: 2010-12-08T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Pluripotent Stem Cells by using Cryosections of Embryoid Bodies at JoVE.com

इस काम Fundação डे Amparo द्वारा समर्थित किया गया था एक Pesquisa एस्टाडो रियो डी जनेरियो (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico ई (CNPq) Tecnologico और Instituto Nacional de Ciência ई TECNOLOGIA (INCTC). हम Bruna एस Paulsen और EB छवियों के लिए Aline एम. फर्नांडीस के लिए आभारी हैं.

1. फिक्सेशन और cryopreservation Pluripotent स्टेम सेल माउस भ्रूणीय (MEF) fibroblasts mitomycin सी के साथ निष्क्रिय और DMEM/F12 में रखा 20% पीटा सीरम (KSR) प्रतिस्थापन और 8ng / fibroblast वृद्धि कारक के एमएल (FGF-2) के साथ पूरक पर सुसंस्कृत थे. आदेश में EB ग?...

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	<li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-117 (1998).</li><li>Itskovitz-Eldor, J., Schuldiner, M., Karsenti, D., Eden, A., Yanuka, O., Amit, M., Soreq, H., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+compromising+the+three+embryonic+germ+layers.">Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers.</a> Mol Med. 6, 88-95 (2000).</li><li>Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+inducing+embryoid+body+formation:+in+vitro+differentiation+system+of+embryonic+stem+cells.">Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells.</a> J Biosci Bioeng. 103, 389-398 (2007).</li><li>Conley, B. J., Young, J. C., Trounson, A. O., Mollard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+propagation+and+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Derivation propagation and differentiation of human embryonic stem cells.</a> Int J Biochem Cell Biol. 36, 555-567 (2004).</li><li>Moon, I. S., Cho, S. J., Jin, I., Walikonis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+combined+fluorescence+in+situ+hybridization+and+immunocytochemistry.">A simple method for combined fluorescence in situ hybridization and immunocytochemistry.</a> Mol Cells. 24, 76-82 (2007).</li><li>Daneshtalab, N., Dor&#233;, J. J., Smeda, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+tissue+specificity+and+antibody+selection:+Procedures+in+immunohistochemical+studies.">Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 61, 127-135 (2009).</li><li>Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-induced+antigen+retrieval+for+immunohistochemical+reactions+in+routinely+processed+paraffin+sections.">Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections.</a> Methods Mol Biol. , 588-5103 (2010).</li><li>Nones, J., Spohr, T. C., Furtado, D. R., Sartore, R. C., Paulsen, B. S., Guimar&#227;es, M. Z., Rehen, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+modulate+cell+survival+in+embryoid+bodies.">Cannabinoids modulate cell survival in embryoid bodies.</a> Cell Biol Int. 12, 399-408 (2010).</li><li>Huang, W. M., Gibson, S. J., Facer, P., Gu, J., Polak, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+section+adhesion+for+immunocytochemistry+using+high+molecular+weight+polymers+of+L-lysine+as+a+slide+coating.">Improved section adhesion for immunocytochemistry using high molecular weight polymers of L-lysine as a slide coating.</a> Histochemistry. 77, 275-279 (1983).</li><li>Kuenzi, M. J., Sherwood, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localization+of+specific+relaxin-binding+cells+in+thecervix,+mammary+glands,+and+nipples+of+pregnant+rats.">Immunohistochemical localization of specific relaxin-binding cells in thecervix, mammary glands, and nipples of pregnant rats.</a> Endocrinology. 136, 1367-1373 (1995).</li></ol>

विधि यहाँ वर्णित प्रदान करता है एक आसान - का पालन प्रोटोकॉल के लिए पीएफए ​​तय immunofluorescence के लिए और स्वस्थानी संकरण assays में उपयोगी embryoid निकायों की पतली cryostat वर्गों प्राप्त है . परिणामस्वरूप cryosections मानव भ्र?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>D (+) Sucrose</td>
<td>Reagent</td>
<td>Vetec</td>
<td>228</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>Reagent</td>
<td>Rieden-de Ha&euml;n</td>
<td>16005</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS solution</td>
<td>Reagent</td>
<td>LGC Biotecnology</td>
<td>13-30259.05</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P2636</td>
<td>200mg/mL in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sakura</td>
<td>P2636</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose Solution</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10% Sucrose Solution in PBS w/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Sucrose Solution</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>20% Sucrose Solution in PBS w/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Sucrose Solution</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>30% Sucrose Solution in PBS w/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Conic Tube</td>
<td>Tool</td>
<td>TPP</td>
<td>91015</td>
<td>15mL conic tube</td>
</tr>
<tr>
<td>Plate shaker</td>
<td>Tool</td>
<td>Biomixer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cryostat</td>
<td>Tool</td>
<td>Leica</td>
<td>CM 1850</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mold for OCT platform</td>
<td>Tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Plastic mold plataform</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

analysis of pluripotent stem cells by using cryosections of embryoid bodies

भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ते) pluripotent ब्लास्टोसिस्ट चरण जल्दी स्तनधारी एक भ्रूण के भीतर सेल मास से प्राप्त कोशिकाओं रहे हैं. ES कोशिकाओं की भिन्नता में एक महत्वपूर्ण चरण embryoid निकायों के गठन (ईबीएस) समुच्चय 2, 3 है. EB गठन सहज एकत्रीकरण पर आधारित है जब ES कोशिकाओं गैर पक्षपाती प्लेटों में सुसंस्कृत हैं. बाह्य त्वक स्तर mesoderm, और 4 endoderm: तीन आयामी EB recapitulates जल्दी स्तनधारी embryogenesis के कई पहलुओं और तीन रोगाणु परतों में अंतर है . Immunofluorescence और स्वस्थानी संकरण में व्यापक रूप से लक्ष्य प्रोटीन और mRNA एक ऊतक धारा 5, 6, 7 की कोशिकाओं में मौजूद का पता लगाने के के लिए तकनीक का इस्तेमाल कर रहे हैं. यहाँ हम embryoid निकायों के उच्च गुणवत्ता cryosections उत्पन्न करने के लिए एक सरल तकनीक मौजूद है. इस दृष्टिकोण अक्टूबर में EB एम्बेडिंग के स्थानिक उन्मुखीकरण cryosection तकनीक द्वारा पीछा किया पर निर्भर करता है. परिणामस्वरूप वर्गों विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत विविधता के अधीन किया जा सकता है क्रम में कुछ प्रोटीन, शाही सेना या डीएनए युक्त कोशिकाओं की आबादी विशेषताएँ. इस अर्थ में, EB cryosections की तैयारी (10μm) ऊतक विज्ञान धुंधला विश्लेषण के लिए आवश्यक उपकरण (जैसे Hematoxilin और Eosin, DAPI), (Oct4 जैसे, nestin) immunofluorescence या स्वस्थानी संकरण में हैं. इस तकनीक को भी त्रि - आयामी ईबीएस के गोलाकार संरचना के रखरखाव के साथ संबंध है embryogenesis के पहलुओं को समझने में मदद कर सकते हैं.

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Analysis of Pluripotent Stem Cells by using Cryosections of Embryoid Bodies

Pluripotent स्टेम निलंबन में बढ़ कोशिकाओं embryoid निकायों (ईबीएस) में अंतर है. यहाँ हम प्रदर्शन कैसे उच्च गुणवत्ता EB embryogenesis के सेलुलर और आणविक पहलुओं का अध्ययन करने के लिए उपयोगी cryosections प्राप्त करने के लिए, जबकि समुच्चय के रूप में उनके संगठन के संरक्षण.

Pluripotent स्टेम सेल की embryoid निकायों के Cryosections का उपयोग करके विश्लेषण

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Research

JoVE Journal

Biology

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Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

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