Name: analysis of pluripotent stem cells by using cryosections of embryoid bodies
Uploaded: 2010-12-08T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Pluripotent Stem Cells by using Cryosections of Embryoid Bodies at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pela Fundação de Amparo Pesquisa um do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia (INCTC). Somos gratos a Bruna Paulsen e S. M. Aline Fernandes para as imagens EB.

1. Fixação e Criopreservação Células-tronco pluripotentes foram cultivados em fibroblastos de rato embrionárias (MEF) inativados com mitomicina C e mantidos em DMEM/F12 suplementado com a substituição knockout 20% de soro (KSR) e 8ng / mL do fator de crescimento de fibroblastos (FGF-2). , A fim de induzir a formação de células H9 EB foram transferidos para a não-aderente pratos e cultivadas por 7 dias, mantidos em DMEM/F12 suplementado com 15% KSR 8. Nota (!...

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	<li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-117 (1998).</li><li>Itskovitz-Eldor, J., Schuldiner, M., Karsenti, D., Eden, A., Yanuka, O., Amit, M., Soreq, H., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+compromising+the+three+embryonic+germ+layers.">Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers.</a> Mol Med. 6, 88-95 (2000).</li><li>Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+inducing+embryoid+body+formation:+in+vitro+differentiation+system+of+embryonic+stem+cells.">Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells.</a> J Biosci Bioeng. 103, 389-398 (2007).</li><li>Conley, B. J., Young, J. C., Trounson, A. O., Mollard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+propagation+and+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Derivation propagation and differentiation of human embryonic stem cells.</a> Int J Biochem Cell Biol. 36, 555-567 (2004).</li><li>Moon, I. S., Cho, S. J., Jin, I., Walikonis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+combined+fluorescence+in+situ+hybridization+and+immunocytochemistry.">A simple method for combined fluorescence in situ hybridization and immunocytochemistry.</a> Mol Cells. 24, 76-82 (2007).</li><li>Daneshtalab, N., Dor&#233;, J. J., Smeda, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+tissue+specificity+and+antibody+selection:+Procedures+in+immunohistochemical+studies.">Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 61, 127-135 (2009).</li><li>Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-induced+antigen+retrieval+for+immunohistochemical+reactions+in+routinely+processed+paraffin+sections.">Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections.</a> Methods Mol Biol. , 588-5103 (2010).</li><li>Nones, J., Spohr, T. C., Furtado, D. R., Sartore, R. C., Paulsen, B. S., Guimar&#227;es, M. Z., Rehen, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+modulate+cell+survival+in+embryoid+bodies.">Cannabinoids modulate cell survival in embryoid bodies.</a> Cell Biol Int. 12, 399-408 (2010).</li><li>Huang, W. M., Gibson, S. J., Facer, P., Gu, J., Polak, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+section+adhesion+for+immunocytochemistry+using+high+molecular+weight+polymers+of+L-lysine+as+a+slide+coating.">Improved section adhesion for immunocytochemistry using high molecular weight polymers of L-lysine as a slide coating.</a> Histochemistry. 77, 275-279 (1983).</li><li>Kuenzi, M. J., Sherwood, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localization+of+specific+relaxin-binding+cells+in+thecervix,+mammary+glands,+and+nipples+of+pregnant+rats.">Immunohistochemical localization of specific relaxin-binding cells in thecervix, mammary glands, and nipples of pregnant rats.</a> Endocrinology. 136, 1367-1373 (1995).</li></ol>

O método descrito aqui fornece um fácil de seguir o protocolo para obter PFA seções fixas criostato fina de corpos embrióides útil para imunofluorescência e em ensaios de hibridização in situ. O criosecções resultando permitir o estudo de aspectos celulares e moleculares da embrionárias humanas diferenciação de células-tronco, preservando a sua estrutura e organização como agregados.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>D (+) Sucrose</td>
<td>Reagent</td>
<td>Vetec</td>
<td>228</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>Reagent</td>
<td>Rieden-de Ha&euml;n</td>
<td>16005</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS solution</td>
<td>Reagent</td>
<td>LGC Biotecnology</td>
<td>13-30259.05</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly-L-lysine hydrobromide</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P2636</td>
<td>200mg/mL in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sakura</td>
<td>P2636</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose Solution</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10% Sucrose Solution in PBS w/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Sucrose Solution</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>20% Sucrose Solution in PBS w/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Sucrose Solution</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>30% Sucrose Solution in PBS w/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Conic Tube</td>
<td>Tool</td>
<td>TPP</td>
<td>91015</td>
<td>15mL conic tube</td>
</tr>
<tr>
<td>Plate shaker</td>
<td>Tool</td>
<td>Biomixer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cryostat</td>
<td>Tool</td>
<td>Leica</td>
<td>CM 1850</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mold for OCT platform</td>
<td>Tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Plastic mold plataform</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

analysis of pluripotent stem cells by using cryosections of embryoid bodies

-Tronco embrionárias (ES) são células pluripotentes derivadas da massa celular interna do blastocisto estágio precoce de embriões de mamíferos 1. A fase crucial na diferenciação de células-tronco embrionárias é a formação de corpos embrióides (EBs) agregados 2, 3. EB formação é baseada na agregação espontânea, quando as células ES são cultivadas em placas não aderente. Recapitula tridimensional EB muitos aspectos da embriogênese de mamíferos cedo e se diferenciam em três camadas germinativas: ectoderma, mesoderma e endoderma 4. Imunofluorescência e hibridização in situ são amplamente utilizadas técnicas para a detecção de proteínas-alvo e mRNA presente nas células de uma secção de tecido 5, 6, 7. Aqui nós apresentamos uma técnica simples para gerar criosecções alta qualidade dos corpos embrióides. Esta abordagem baseia-se na orientação espacial do EB incorporação em outubro seguido pela técnica cryosection. As seções resultante pode ser submetida a uma ampla variedade de procedimentos analíticos, a fim de caracterizar as populações de células que contêm certas proteínas, RNA ou DNA. Neste sentido, a preparação da EB criosecções (10μm) são ferramentas essenciais para análise histológica coloração (por exemplo, Hematoxilina e Eosina, DAPI), imunofluorescência (por exemplo, Oct4, nestina) ou hibridização in situ. Esta técnica pode também ajudar a compreender aspectos da embriogênese no que diz respeito à manutenção da estrutura tri-dimensional esférica de EBs.

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Analysis of Pluripotent Stem Cells by using Cryosections of Embryoid Bodies

Células-tronco pluripotentes de crescimento em suspensão se diferenciar em corpos embrióides (EBs). Aqui demonstramos como obter criosecções de alta qualidade EB útil para estudar os aspectos celulares e moleculares da embriogênese, preservando a sua organização como agregados.

Análise de células-tronco pluripotentes usando criosecções dos corpos embrióides

Embryonic stem (ES) cells are pluripotent cells derived from the inner cell mass of blastocyst-stage early mammalian embryos 1. A crucial stage in the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Shrinky-Dink Hanging Drops: A Simple Way to Form and Culture Embryoid Bodies

Shrinky Dink-Hanging Drops: Uma maneira simples para formar e Cultura corpos embrióides

Embryoid bodies (EB) are aggregates of embryonic stem cells. The most common way of creating these aggregates is the hanging drop method, a laborious ...

Biologia

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela reprogramação fibroblastos humanos com o Lentivirus TF Stemgent Humanos Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus

Análise imunocitoquímica de células-tronco humanas pluripotentes usando um Self-Made Aparelho Cytospin

Human pluripotent stem cells (hPSCs) that include human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are exciting cell ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Transfectando e Nucleofecting células-tronco pluripotentes induzidas

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramação de células somáticas humanas em células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando vetor retroviral com GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Geração de Células-tronco pluripotentes induzidas a partir de sangue periférico usando o STEMCCA Lentivirus Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

Diferenciação de alta eficiência de pluripotentes humanas células-tronco para Cardiomyocytes e Caracterização por citometria de fluxo

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...