Name: isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients
Uploaded: 2011-02-02T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de National Multiple Sclerosis Society (TA 3021-A1 / T naar AEC) en de Universiteit van Texas in San Antonio.

Bereiding van reagentia Bereid voorraad isotone Percoll (SIP), 4 ml per hersenen, door het mengen van 9 delen van Percoll met een deel van de 10X HBSS zonder Ca + + en Mg + +. Bereid SIP op 70% in 1X HBSS zonder Ca + + en Mg + +, 2 ml per hersenen gedispenseerd in een 15 ml polypropyleen conische buis. Opmerking: Het is aanbevolen dat Percoll moet worden gebruikt bij kamertemperatuur, als het gebruikt wordt koud, de cellen hebben de nei...

<ol>
	<li>Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+direct+characterization+of+resident+microglial+cells+from+the+normal+and+inflamed+central+nervous+system.">Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).</li><li>Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+cell+activation+and+proliferation+precedes+the+onset+of+CNS+autoimmunity.">Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity.</a> J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).</li><li>Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+adult+ramified+microglia+separated+from+other+central+nervous+system+macrophages+by+flow+cytometric+sorting.+Phenotypic+differences+defined+and+direct+ex+vivo+antigen+presentation+to+myelin+basic+protein-reactive+CD4++T+cells+compared.">Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared.</a> J Immunol. 154, 4309-4321 (1995).</li><li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry.">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li><li>Juedes, A. E., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+and+infiltrating+central+nervous+system+APCs+regulate+the+emergence+and+resolution+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Resident and infiltrating central nervous system APCs regulate the emergence and resolution of experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J. Immunol. 166, 5168-5175 (2001).</li><li>Prinz, M., Priller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tickets+to+the+brain:+Role+of+CCR2+and+CX(3)CR1+in+myeloid+cell+entry+in+the+CNS.">Tickets to the brain: Role of CCR2 and CX(3)CR1 in myeloid cell entry in the CNS.</a> J Neuroimmunol. , (2010).</li><li>Mildner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+the+adult+brain+arise+from+Ly-6ChiCCR2++monocytes+only+under+defined+host+conditions.">Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions.</a> Nat. Neurosci. 10, 1544-1553 (2007).</li><li>Djukic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+monocytes+engraft+in+the+brain,+differentiate+into+microglia+and+contribute+to+the+pathology+following+meningitis+in+mice.">Circulating monocytes engraft in the brain, differentiate into microglia and contribute to the pathology following meningitis in mice.</a> Brain. 129, 2394-2403 (2006).</li></ol>

Analyses van celoppervlaktemerkers in het CZS leukocyten uit normale muis ontstoken weefsels zijn gebruikt voor enkele decennia 1-3. Isolatie protocollen zijn gebaseerd op de scheiding van microglia en leukocyten door de dichtheid centrifugeren 4. Hier beschrijven we een snelle en effectieve methode voor het isoleren van CNS leukocyten met behulp van discontinue Percoll gradiënten. Na isolatie van cellen, kleuring met verschillende antilichamen, zoals-maar niet beperkt tot-CD45, CD4, CD8, CD11b, C...

Tissue homogenisering en verlopen <ul><li> Percoll (Amersham) </li><li> Balanced Salt 10X Hanks &#39;Solution, zonder Calcium en Magnesium (Gibco) </li><li> RPMI Medium 1640, zonder fenol rood (Gibco) </li><li> 7-ml of 15 ml Dounce Tissue Grinders (VWR) </li></ul> Flowcytometrie <ul><li> Cel Staining Buffer (Biolegend) </li><li> Gezuiverd Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Muis BD Fc Block), BD Pharmingen </li><li> Hemacytometer (Fisher) </li><li> Anti-muis CD45 (kloon 30-F11), CD4 (kloon RM4-5), CD19 (kloon 6D5), BioLegend </li><li> 10X fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing, zonder Calcium en Magnesium (Thermo Scientific) </li><li> Paraformaldehyd (Sigma Aldrich) </li><li> Flowcytometrie-analyse uitgevoerd met een LSR II (BD Biosciences) </li></ul>

isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients

Isolatie van immuuncellen die het centrale zenuwstelsel (CZS) tijdens infectie, trauma, auto-immuniteit of neurodegeneratie infiltreren, is het vaak nodig om hun fenotype en effector functies te definiëren. Histochemische benaderingen zijn wat belangrijk is voor de locatie van de infiltrerende cellen te bepalen en om de bijbehorende CNS pathologie analyseren. Echter, in-situ histochemie en immunofluorescentie kleuringstechnieken beperkt door het aantal antilichamen die gebruikt kunnen worden in een keer om immuun cel subtypen karakteriseren in een specifiek weefsel. Daarom, histologische benadering in combinatie met immuun-fenotypering door flowcytometrie zijn cruciaal voor het volledig karakteriseren van de samenstelling van de lokale CNS infiltratie. Dit protocol is gebaseerd op de scheiding van CNS cellulaire suspensies meer dan discontinous Percoll gradiënten. Het huidige artikel beschrijft een snelle protocol om efficiënt te isoleren mononucleaire cellen van hersenen en het ruggenmerg weefsels die effectief kan worden gebruikt voor de identificatie van verschillende immuun celpopulaties in een enkel monster door flowcytometrie.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients at JoVE.com

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

Het huidige artikel beschrijft een snelle protocol om efficiënt te isoleren mononucleaire cellen van hersenen en het ruggenmerg weefsels die effectief kan worden gebruikt voor flowcytometrische analyses.

Isolatie van hersenen en ruggenmerg mononucleaire cellen met behulp van Percoll Verlopen

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

Isolatie van Brain-infiltrerende leukocyten

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Isolatie van Precursor B-cel subsets van navelstrengbloed

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolatie van myeloïde dendritische cellen en epitheelcellen van Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolatie en Flow cytometrische analyse van de immuuncellen van de ischemische hersenen van muizen

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolatie en Flow cytometrische analyse van Glioom infiltreren perifere mononucleaire bloedcellen

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

Isolatie van lamina propria mononucleaire cellen van Murine Colon met behulp van Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

Isolatie van tonsillaire mononucleaire cellen om ex vivo ingeboren immuunreacties te bestuderen in een menselijk mucosale lymfoïde weefsel

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...

Flotation-Based T Cell Isolation, Activation, and Expansion from Human Peripheral Blood Mononuclear Cell Samples Using Microbubbles

Op flotatie gebaseerde T-celisolatie, activering en uitbreiding van menselijke perifere bloedmononucleaire celmonsters met behulp van microbubbels

The process of isolating T cells from peripheral blood mononuclear&#160;cells (PBMCs) to establish ex vivo cultures is crucial for research, clinical ...

PBMC Collection and Cryostorage for Mitochondrial Bioenergetics Analysis

Cryopreservation and Bioenergetic Evaluation of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells

Preservation of Bioenergetic Parameters in Peripheral Blood Mononuclear Cells After Cryopreservation (Video) | JoVE

Cryopreservatie en bio-energetische evaluatie van mononucleaire cellen in menselijk perifeer bloed

The physiological functions of eukaryotic cells rely on energy mainly provided by mitochondria. Mitochondrial dysfunction is linked to metabolic diseases ...

Histological Staining of Spinal Cord for Assessing EAE Disease Severity

Scoring Central Nervous System Inflammation, Demyelination, and Axon Injury in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Unveiling the Pathway Linking Obesity to Autoimmune Inflammation in Multiple Sclerosis (Video) | JoVE

Scoren van ontsteking, demyelinisatie en axonletsel van het centrale zenuwstelsel bij experimentele auto-immuunencefalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a common immune-based model of multiple sclerosis (MS). This disease can be induced in rodents by ...