Name: monitoring immune cells trafficking fluorescent prion rods hours after intraperitoneal infection
Uploaded: 2010-11-19T17:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection at JoVE.com

Wir danken Steve McBryant und Jeff Hansen für die Hilfe bei Ultrazentrifugation und Patti Kiser für die Hilfe bei der Maus Handhabung. Das Nationale Institut für neurologische Erkrankungen und Schlaganfall an den National Institutes of Health, gewähren 5R01NS056379-02 finanziert diese Arbeit.

<html> 1. Reinigung und Labeling Prion Rods Dieses Protokoll wird von einem zuvor veröffentlichten 18 angepasst <ol><li> Homogenisieren 100 Gramm Prion-infizierten Hirngewebe in 900 ml eiskaltem Homogenisierungspuffer (HB, 1X PBS mit 320 mM Saccharose, 150 mM NaCl und 4mm EDTA) 1 min bei maximaler Geschwindigkeit in einer kommerziellen Mixer, dann 2 min auf Eis. Dreimal wiederholen. </li><li> Centrifuge Homogenat 10 min bei 3000 xg und 4 ° C. Entfernen Sie und speichern Sie auf...

<ol>
	<li>Klein, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crucial+role+for+B+cells+in+neuroinvasive+scrapie.">A crucial role for B cells in neuroinvasive scrapie.</a> Nature. 390, 687-687 (1997).</li><li>Mabbott, N. A., Farquhar, C. F., Brown, K. L., Bruce, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+immune+system+in+TSE+pathogenesis.">Involvement of the immune system in TSE pathogenesis.</a> Immunol Today. 19, 201-201 (1998).</li><li>Sigurdson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrP(CWD)+lymphoid+cell+targets+in+early+and+advanced+chronic+wasting+disease+of+mule+deer.">PrP(CWD) lymphoid cell targets in early and advanced chronic wasting disease of mule deer.</a> J Gen Virol. 83, 2617-2617 (2002).</li><li>Klein, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+facilitates+early+prion+pathogenesis.">Complement facilitates early prion pathogenesis.</a> Nat Med. 7, 488-488 (2001).</li><li>Mabbott, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+depletion+of+complement+component+C3+or+genetic+deficiency+of+C1q+significantly+delays+onset+of+scrapie.">Temporary depletion of complement component C3 or genetic deficiency of C1q significantly delays onset of scrapie.</a> Nat Med. 7, 485-485 (2001).</li><li>Zabel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+Complement+Receptor+CD21/35+Facilitates+Lymphoid+Prion+Colonization+and+Pathogenesis.">Stromal Complement Receptor CD21/35 Facilitates Lymphoid Prion Colonization and Pathogenesis.</a> J Immunol. 179, 6144-6144 (2007).</li><li>Cordier-Dirikoc, S., Chabry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+depletion+of+CD11c++dendritic+cells+delays+lymphoinvasion+after+intraperitonal+scrapie+infection.">Temporary depletion of CD11c+ dendritic cells delays lymphoinvasion after intraperitonal scrapie infection.</a> J Virol. 82, 8933-8933 (2008).</li><li>Dorban, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+scrapie+infection+modifies+the+homeostasis+of+Peyer's+patches'+dendritic+cells.">Oral scrapie infection modifies the homeostasis of Peyer's patches' dendritic cells.</a> Histochem Cell Biol. 128, 243-243 (2007).</li><li>Flores-Langarica, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrapie+pathogenesis:+the+role+of+complement+C1q+in+scrapie+agent+uptake+by+conventional+dendritic+cells.">Scrapie pathogenesis: the role of complement C1q in scrapie agent uptake by conventional dendritic cells.</a> J Immunol. 182, 1305-1305 (2009).</li><li>Huang, F. P., MacPherson, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+oral+transmission+of+prion+diseases.">Dendritic cells and oral transmission of prion diseases.</a> Adv Drug Deliv Rev. 56, 901-901 (2004).</li><li>Ano, Y., Sakudo, A., Nakayama, H., Onodera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+dynamics+of+infectious+prion+protein+in+the+intestine.">Uptake and dynamics of infectious prion protein in the intestine.</a> Protein Pept Lett. 16, 247-247 (2009).</li><li>Aucouturier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infected+splenic+dendritic+cells+are+sufficient+for+prion+transmission+to+the+CNS+in+mouse+scrapie.">Infected splenic dendritic cells are sufficient for prion transmission to the CNS in mouse scrapie.</a> J Clin Invest. 108, 703-703 (2001).</li><li>Huang, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migrating+intestinal+dendritic+cells+transport+PrP(Sc)+from+the+gut.">Migrating intestinal dendritic cells transport PrP(Sc) from the gut.</a> J Gen Virol. 83, 267-267 (2002).</li><li>Jeffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transportation+of+prion+protein+across+the+intestinal+mucosa+of+scrapiesusceptible+and+scrapie-resistant+sheep.">Transportation of prion protein across the intestinal mucosa of scrapiesusceptible and scrapie-resistant sheep.</a> J Pathol. 209, 4-4 (2006).</li><li>Raymond, C. R., Mabbott, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+involvement+of+migratory+dendritic+cells+in+the+transfer+of+the+scrapie+agent+from+the+immune+to+peripheral+nervous+systems.">Assessing the involvement of migratory dendritic cells in the transfer of the scrapie agent from the immune to peripheral nervous systems.</a> J Neuroimmunol. 187, 114-114 (2007).</li><li>Mohan, J., Hopkins, J., Mabbott, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-derived+dendritic+cells+acquire+and+degrade+the+scrapie+agent+following+in+vitro+exposure.">Skin-derived dendritic cells acquire and degrade the scrapie agent following in vitro exposure.</a> Immunology. 116, 122-122 (2005).</li><li>Gilch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG+and+LPS+can+interfere+negatively+with+prion+clearance+in+macrophage+and+microglial+cells.">CpG and LPS can interfere negatively with prion clearance in macrophage and microglial cells.</a> FEBS J. 274, 5834-5834 (2007).</li><li>Safar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mass,+biochemical+composition,+and+physicochemical+behavior+of+the+infectious+form+of+the+scrapie+precursor+protein+monomer.">Molecular mass, biochemical composition, and physicochemical behavior of the infectious form of the scrapie precursor protein monomer.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 87, 6373-6373 (1990).</li><li>B&#252;eler, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+devoid+of+PrP+are+resistant+to+scrapie.">Mice devoid of PrP are resistant to scrapie.</a> Cell. 73, 1339-1339 (1993).</li></ol>

Hier zeigen wir ein Protokoll für die Kennzeichnung und Nachverfolgung Prionen in vivo, dass erleichtert die Überwachung frühen Ereignisse in peripheren Prion-Infektion. Dieses Protokoll verbessert auf die bisherigen Versuche mit Überwachung Prion-Aufnahme in vitro 9 und in vivo 3,12 von pre-Kennzeichnung hochangereichertes Prion Inokulum eindeutig unterscheiden sie von endogenen PrP C. Da infektiöse Prionen und PrP C die gleiche primäre Aminos...

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CWD-infected elk brain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Private elk farm in Colorado</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use any non-human prion-infected brain</td>
</tr>
<tr>
<td>Blender</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Oster</td>
<td>6694-015</td>
<td>Use any commercial blender</td>
</tr>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sorvall</td>
<td>SS34 rotor</td>
<td>Use any centrifuge /rotor that can reach 3000 x g and hold &ge; 500 ml volumes</td>
</tr>
<tr>
<td>Ultracentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman</td>
<td>50.2 Ti rotor</td>
<td>Use any ultracentrifuge /rotor that can reach 100,000 x g and hold &ge; 500 ml volumes</td>
</tr>
<tr>
<td>Bradford Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>B6916</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Complete mini protease inhibitor cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11 836 170 001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sonicator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Misonix</td>
<td>MP4000X</td>
<td>Use any horn or probe sonicator set to ~70% max power</td>
</tr>
<tr>
<td>DyLight antibody Labeling kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>53050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>microcentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>55430R</td>
<td>Use any refrigerated microcentrifuge that can achieve 13,000x g</td>
</tr>
<tr>
<td>centrifugal filter columns</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>Microcon YM-100</td>
<td>Use any filter or dialysis membrane with 100 Kd molecular weight cutoff</td>
</tr>
<tr>
<td>8-40 week-old FVB mice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Charles River</td>
<td>207</td>
<td>Use any inbred mouse strain</td>
</tr>
<tr>
<td>1 &mu;m red fluorescent beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Phosphorex</td>
<td>2307</td>
<td>Use any fluorescent bead &le; 10 &mu;m</td>
</tr>
<tr>
<td>RPMI 1640 medium </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11875-093</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>40 &mu;m cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>352340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>fluorescent antibodies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD pharmingen</td>
<td>Various</td>
<td>Use any fluorescent antibody appropriate for your application.</td>
</tr>
<tr>
<td>flow cytometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dakocytomation</td>
<td>CyanADP</td>
<td>Use any flow cytometer capable of multicolor fluorescence detection</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

monitoring immune cells trafficking fluorescent prion rods hours after intraperitoneal infection

Vorhandensein einer anomalen Form eines Host-kodierten Prion-Protein (PrP), die Protease resistent, pathologische und ansteckend ist charakterisiert Prion-Erkrankungen wie das Chronic Wasting Disease (CWD) der Cerviden und Scrapie bei Schafen. Die Prion-Hypothese behauptet, dass dieses abnorme Konformer die meisten oder alle der infektiösen Prionen darstellt. Die Rolle des Immunsystems in der frühen Ereignisse in peripheren Prion Pathogenese konnte überzeugend für CWD und Scrapie 1-3 gezeigt. Transgene und pharmakologische Studien an Mäusen zeigten eine wichtige Rolle des Komplementsystems bei der Bindung und Replikation von Prionen früh nach der Infektion 4-6. In-vitro-und In-vivo-Studien haben auch Prionen Retention durch dendritische Zellen 7-10 beobachtet, obwohl ihre Rolle in Handel bleibt Unklar 11-16. Makrophagen sind ebenfalls in der frühen Prion Pathogenese in Verbindung gebracht, aber diese Studien haben sich auf Ereignisse, die Wochen nach der Infektion 3,11,17 konzentriert. Diese früheren Studien leiden auch unter dem Problem der Unterscheidung zwischen endogenen PrP C und infektiöse Prionen. Hier beschreiben wir eine semiquantitative, unvoreingenommene Herangehensweise für die Beurteilung der Prion-Aufnahme und-handel von der Impfstelle von Immunzellen rekrutiert dort. Aggregierte Prion Stäbe wurden aus infizierten Hirnhomogenat durch Waschmittel Solubilisierung von nicht aggregierten Proteinen und Ultrazentrifugation durch ein Saccharose-Kissen gereinigt. Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Coomassie Blau-Färbung und Western Blot bestätigt Erholung von hoch angereichertem Prion Stangen in die pelletierten Fraktion. Prion Stangen wurden Fluorochrom-markierte dann intraperitoneal in Mäuse. Zwei Stunden später Immunzellen aus Peritoneallavage Flüssigkeit, Milz und mediastinalen und mesenterialen Lymphknoten wurden für Prion Stabrückhaltesystem und Zell-Untergruppen von multicolor Durchflusszytometrie unter Verwendung von Markern für Monozyten, Neutrophile, dendritische Zellen, Makrophagen und B-und T-Zellen identifiziert untersucht. Dieser Test ermöglicht es zum ersten Mal die direkte Überwachung der Immunzellen Erwerb und Handel mit Prionen in vivo innerhalb von Stunden nach der Infektion. Dieser Assay auch deutlich unterscheidet infektiöse, aggregiert Prionen aus PrPC in der Regel auf dem Host-Zellen exprimiert, die als schwierig und führt zur Interpretation der Daten Probleme in anderen Testsystemen können. Dieses Protokoll kann auch auf andere Impfung Routen (orale, intravenöse, intranervous und subkutanen, zB) und Antigene (konjugierte Beads, bakteriellen, viralen und parasitären Erregern und Proteine, Ei) als auch angepasst werden.

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Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection

Hier beschreiben wir eine neuartige Assays für die Überwachung der Prion-Aufnahme und-handel durch Immunzellen sofort nach intraperitonealer Inokulation durch Reinigung und Fluoreszenzmarkierung aggregierte Prion Stangen aus infizierten Gehirn Material dann die Überwachung ihrer Aufnahme und Bewegung an der Injektionsstelle und Charakterisierung der Zellen Vermittlung dieser Ereignisse.

Überwachung Immunzellen Trafficking Fluorescent Prion Rods Stunden nach intraperitonealer Infektion

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such ...

Research

JoVE Journal

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