Name: western blotting: sample preparation to detection
Uploaded: 2010-10-14T17:27:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Western Blotting: Sample Preparation to Detection at JoVE.com

1. Подготовка образцов Первый шаг в западных промокательной является пробоподготовки. Для подготовки образцов для запуска геля клетки и ткани должны быть лизируются для освобождения белков, представляющих интерес. <ul><li> Удобный, готовый к использованию реагента, который является универсальным и простым в использовании для извлечения растворимого белка CytoBuster или PhosphoSafe. Эти добычи буферы содержат моющие средства оптимизированы для эффективного извлечения растворимых белков млекопитающих и клетки насекомых. Нежный, без ионного состава CytoBuster реагента извлечения белка позволяет изоляции функционально активных эндогенных или выразили белков без необходимости вторичной очистки, такие как ультразвуком или замораживания / оттаивания. PhoshoSafe имеет дополнительное преимущество, содержащий четыре ингибиторов фосфатазы. <ol><li> Гранул клеток центрифугированием низкой скорости (например, 5 мин при 2500 мкг), процедить осадок клеток хорошо. </li><li> Ресуспендируют клеток в CytoBuster белка Добыча реагента использовании 150 мкл на 10 6 клеток (оптимальное количество реагента CytoBuster извлечения белка может меняться в зависимости от размера ячейки). </li><li> Инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин. </li><li> Трансфер в подходящую трубку и спина в течение 5 мин при 16 000 мкг при 4 ° C. </li><li> Передача очищается супернатант (клеточного экстракта) в новую пробирку и приступить к анализу. </li></ol></li><li> Для специализированных извлечения белка, мы рекомендуем использовать наши высококачественные ProteoExtract Kits. EMD имеет более десятка наборов для митохондриальных изоляции, субклеточном добычи протеома, добыче трансмембранного белка, и многие другие. Пожалуйста, посетите наши западные целевую страницу пятном для дальнейших подробностей. </li><li> EMD также продает широкий спектр протеаз и фосфатазы наборов ингибитор коктейль. Как только происходит лизис, протеолиз, дефосфорилирование, и денатурация начать. Эти события могут быть замедлены чрезвычайно если образцы хранятся на льду или при температуре 4 ° С во все времена и соответствующие ингибиторы добавляют в свежем виде лизис буфера. Пожалуйста, посетите наши западные целевую страницу пятном для дальнейших подробностей. </li></ul> 2. SDS-PAGE Второй шаг в западных промокательной является разделения белков. Белки отделить на основе молекулярной массой. <ul><li> Вы можете сделать свой собственный геля ПААГ, однако мы будем использовать коммерчески сборных геля. <ol><li> После подготовки образца, вы готовы для определения концентрации белка. EMD имеет два набора для этого, чтобы измерять концентрацию, один из которых без Вмешательство белка Kit пробирной, а другой Пробирной BCA белка Kit. </li><li> Как только концентрация белка оценивается мы готовы подготовить нашу выборку для загрузки геля. Антитела обычно признают небольшую часть белок (именуемые эпитопа), и этот домен может находиться внутри 3D конформации белка. Чтобы разрешить доступ антитела к этой части надо разворачиваться белка. </li><li> Для денатурации, используйте загрузки буфера с анионными денатурирующих моющего средства додецилсульфата натрия (SDS), и кипятить смесь на 95-100 ° С в течение 5 минут. Легкой и удобной погрузки буфер для использования 4X буфера проб. </li></ol></li><li> Поместите первую полосу хорошо Трейл маркерный белок Mix. Этот маркер имеет три ссылки полосы, которые позволяют контролировать электрофореза. Когда гель испачкается, 10 полос видны в пределах от 10-225 кДа. </li><li> Заполните электрофореза единицы проточной буфера. Для PAGE гелей, это, как правило 1X Трис-глицин. Для получения подробных рецептов буфера, посетить Западную промокательной странице. EMD предлагает высококачественные буферами реагентов с нашей линии химического OmniPur. Выполнить геля при 220 В в течение 1 часа. </li><li> Как только белки разделены, пятно геля Кумасси синий обеспечить белки мигрируют ровно и равномерно. RAPIDstain является сверхчувствительных пятно, которое готово к использованию. Нет destaining не требуется. </li></ul> 3. Белка-переносчика Так же, как белки с электрическим зарядом могут быть вызваны путешествовать по геля в электрическом поле, так что может быть передано белков в электрическом поле из геля на мембрану, быть или PVDF или нитроцеллюлозы. <ul><li> Сегодня мы будем делать мокрой передачи. В мокрых передачи, гель и мембрана зажаты между губкой и бумаги (губки / бумага / гель / мембрана / бумага / губка) и все зажаты плотно вместе после того, гарантируя, что ни воздушные пузыри образовались между гелем и мембраной. Сэндвич погружен в передаче буфера для которых электрические поля. Отрицательно заряженные белки путешествия к положительно заряженному электроду, но мембрана останавливает их, связывает их и не позволяет им продолжать далее. </li><li> Два типа мембран доступны: нитроцеллюлоза и PVDF. И работать хорошо. Сегодня мы будем использовать PVDF. PVDF мембраны требуют замачивания в метанол в течение нескольких минут, а затем ледяной буфера передачи в течение 5 минут. Гель также необходимо, чтобы уравновесить в течение нескольких минут в ледяной буфер передачи. Невыполнение этого требования может сократиться гель при передаче. </li><li> Буфера для влажной передачи 1X Трис-глицин, с 20% метанола. Подробная подготовка буфера доступны на нашем сайте. </li><li> После завершения передачи, это хорошая идея, чтобы визуализировать белки, чтобы гарантировать даже передачи без каких-либо воздушных карманов. Это можно легко сделать с Blot RedAlert Западной пятно. Это пятно является готовой к использованию и destaining можно легко сделать с водой. </li></ul> 4. Антитела и аксессуаров Реагенты <ul><li> Первым шагом в этом зондирования и антитела к антигену, чтобы блокировать мембраны. Блокировка мембрана предотвращает неспецифическую фоне обязательными. </li><li> Либо обезжиренного молока или БСА может быть использован как блокирование решения. Однако при использовании фосфорно-специфические антитела, это не рекомендуется использовать молоко, то это вызовет высокий фон. </li><li> EMD предлагает несколько высококачественных блокирование реагентов, в том числе SeaBlock, которая не является млекопитающим блокирующий агент и промокните QuickBlocker, который готовят, готовый к использованию блокирующий агент. У нас также есть высококачественные BSA (доля V) имеется. <ol><li> Инкубируйте мембраны 1 час при комнатной температуре, при легком волнении. </li><li> Вымойте три раза в TBST или PBST после инкубации. Легкий и удобный способ сделать TBST или PBST является использование нашего таблетки (PBS ТВИН Таблетки / TBS ТВИН таблетки) </li></ol></li><li> Как только мембрана была заблокирована, вы готовы для инкубации с первичными антителами. EMD года предлагает полный портфель исключительных антител с лучшими антител гарантии в промышленности на протяжении более 30 лет. Помните, что все антитела EMD, мы предлагаем полный 100% без риска гарантии. Покупка антитела и использовать его для любых видовой специфичности или приложения вы хотите. Если антитела не работает, чтобы Вы остались довольны, мы предоставим полный кредит, который будет использоваться на любой другой продукт. Для более подробной информации, пожалуйста, посетите наши западные промокательной веб-страницы. <ol><li> Сегодня мы будем инкубации нашей главной антител при решении 1 из SignalBoost. SignalBoost большой продукт, позволяющий вашему сигналу быть существенно увеличены. Просто инкубируйте ваших первичных антител в растворе 1 и инкубировать в течение 1 часа или, как вы это обычно делаете. Существует нет необходимости добавить дополнительные блокаторов. Кроме того, вы можете использовать BSA или обезжиренное сухое молоко, как блокирующий агент. </li><li> Промыть TBST. Мы делаем TBST использованием готовых к растворяются TBST таблетки. </li><li> Инкубируйте ваших вторичных антител при решении 2 из SignalBoost. Инкубируйте вторичные антитела в блокирующем буфере в течение 1 часа. Вымойте мембраны еще несколько раз с TBST. </li></ol></li></ul> 5. Обнаружение Для сопряжения HRP вторичными антителами, ECL традиционно используется. Отличные ECL реагента мы предлагаем RapidStep. Преимущества RapidStep в том, что нет смешивания просвета или усилитель не требуется. Просто распылите мембраны несколько раз, и развивать с помощью рентгеновской пленки. RapidStep предлагает низкую чувствительность пиктограмма, а также излучать свет в течение 2 часов после того субстрата.

<ol>
	<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R., R, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera:+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure.">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).</li><li>Burnette, W. N. '. W. e. s. t. e. r. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=blotting':+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate+polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).</li><li>Ambroz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+quantification+accuracy+for+Western+blots+Image+Analysis.">Improving quantification accuracy for Western blots Image Analysis.</a> , (2006).</li><li>Quan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species-mediated+endoplasmic+reticulum+stress+and+mitochondrial+dysfunction+contribute+to+cirsimartitin-induced+apoptosis+in+human+gallbladder+carcinoma+GBC-SD+cells.">Reactive oxygen species-mediated endoplasmic reticulum stress and mitochondrial dysfunction contribute to cirsimartitin-induced apoptosis in human gallbladder carcinoma GBC-SD cells.</a> Cancer Lett Article. , (2010).</li><li>O'Malley, D. e. r. v. i. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+colonic+corticotrophin-releasing+factor+receptors+in+the+maternally+separated+rat+model+of+irritable+bowel+syndrome:+Differential+effects+of+acute+psychological+and+physical+stressors.">Alterations in colonic corticotrophin-releasing factor receptors in the maternally separated rat model of irritable bowel syndrome: Differential effects of acute psychological and physical stressors.</a> Peptides. 31 (4), 662-670 (2010).</li></ol>

Авторы Анна и Джесси Эслами Лухан являются сотрудниками EMD химических Inc, которая производит реактивы и инструменты, используемые в настоящей статье.

В этом видео-презентации, мы выделили основные шаги в западных промокательной которые пробоподготовки, SDS-PAGE, мембранные блокировка / зондирования с антителами, и обнаружения. За каждый шаг процесса, надлежащего протоколы и соответствующие реагенты должны быть использованы для достижения высоких результатов.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CytoBuster&trade; Protein Extraction Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD Chemicals/Merck KGaA</td>
<td>71009</td>
<td><a href="http://www.emdbiosciences.com/cytobuster">www.emdbiosciences.com/cytobuster</a> <a href="http://www.merck4biosciences.com/cytobuster">www.merck4biosciences.com/cytobuster</a></td>
</tr>
<tr>
<td>PhosphoSafe&trade; Extraction Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD Chemicals/Merck KGaA</td>
<td>71296</td>
<td><a href="http://www.emdbiosciences.com/phosphosafe">www.emdbiosciences.com/phosphosafe</a> <a href="http://www.merck4biosciences.com/phosphosafe">www.merck4biosciences.com/phosphosafe</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Non-Interfering Protein Assay&trade; Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD Chemicals/Merck KGaA</td>
<td>488250</td>
<td><a href="http://www.emdbiosciences.com/noninterfering">www.emdbiosciences.com/noninterfering</a> <a href="http://www.merck4biosciences.com/noninterfering">www.merck4biosciences.com/noninterfering</a></td>
</tr>
<tr>
<td>BCA Protein Assay Kit </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD Chemicals/Merck KGaA</td>
<td>71285</td>
<td><a href="http://www.emdbiosciences.com/BCA">www.emdbiosciences.com/BCA</a> <a href="http://www.merck4biosciences.com/BCA">www.merck4biosciences.com/BCA</a></td>
</tr>
<tr>
<td>4X SDS Sample Buffer </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD Chemicals/Merck KGaA</td>
<td>70607</td>
<td><a href="http://www.emdbiosciences.com/4XSDS">www.emdbiosciences.com/4XSDS</a> <a href="http://www.merck4biosciences.com/4XSDS">www.merck4biosciences.com/4XSDS</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Trail Mix&trade; Protein Markers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD Chemicals/Merck KGaA</td>
<td>70980</td>
<td><a href="http://www.emdbiosciences.com/trailmix">www.emdbiosciences.com/trailmix</a> <a href="http://www.merck4biosciences.com/trailmix">www.merck4biosciences.com/trailmix</a></td>
</tr>
<tr>
<td>ProteoExtract&trade; Protein Extraction Kits</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD Chemicals/Merck KGaA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.emdbiosciences.com/proteoextract">www.emdbiosciences.com/proteoextract</a> <a href="http://www.merck4biosciences.com/proteoextract">www.merck4biosciences.com/proteoextract</a></td>
</tr>
<tr>
<td>OmniPur&reg; Products</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD Chemicals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.emdbiosciences.com/omnipur">www.emdbiosciences.com/omnipur</a></td>
</tr>
<tr>
<td>RAPIDstain&trade; Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD Chemicals/Merck KGaA</td>
<td>553215</td>
<td><a href="http://www.emdbiosciences.com/rapidstain">www.emdbiosciences.com/rapidstain</a> <a href="http://www.merck4biosciences.com/rapidstain">www.merck4biosciences.com/rapidstain</a></td>
</tr>
<tr>
<td>RedAlert&trade; 10X Western Blot Stain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD Chemicals/Merck KGaA</td>
<td>71078</td>
<td><a href="http://www.emdbiosciences.com/redalert">www.emdbiosciences.com/redalert</a> <a href="http://www.merck4biosciences.com/redalert">www.merck4biosciences.com/redalert</a></td>
</tr>
<tr>
<td>SeaBlock&trade; Reagent, Salmon Plasma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD Chemicals/Merck KGaA</td>
<td>558300</td>
<td><a href="http://www.emdbiosciences.com/seablock">www.emdbiosciences.com/seablock</a> <a href="http://www.merck4biosciences.com/seablock">www.merck4biosciences.com/seablock</a></td>
</tr>
<tr>
<td>BLOT-QuickBlocker Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD Chemicals/Merck KGaA</td>
<td>WB57</td>
<td><a href="http://www.emdbiosciences.com/quickblocker">www.emdbiosciences.com/quickblocker</a> <a href="http://www.merck4biosciences.com/quickblocker">www.merck4biosciences.com/quickblocker</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Albumin, Bovine Serum, Fraction V</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD Chemicals/Merck KGaA</td>
<td>12660</td>
<td><a href="http://www.emdbiosciences.com/bovineserum">www.emdbiosciences.com/bovineserum</a> <a href="http://www.merck4biosciences.com/bovineserum">www.merck4biosciences.com/bovineserum</a></td>
</tr>
<tr>
<td>PBS-TWEEN&reg; Tablets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD Chemicals/Merck KGaA</td>
<td>524653</td>
<td><a href="http://www.emdbiosciences.com/PBST">www.emdbiosciences.com/PBST</a> <a href="http://www.merck4biosciences.com/PBST">www.merck4biosciences.com/PBST</a></td>
</tr>
<tr>
<td>TBS-TWEEN&reg; Tablets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD Chemicals/Merck KGaA</td>
<td>524753</td>
<td><a href="http://www.emdbiosciences.com/TBST">www.emdbiosciences.com/TBST</a> <a href="http://www.merck4biosciences.com/TBST">www.merck4biosciences.com/TBST</a></td>
</tr>
<tr>
<td>SignalBoost&trade; Immunoreaction Enhancer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD Chemicals/Merck KGaA</td>
<td>407207</td>
<td><a href="http://www.emdbiosciences.com/signalboost">www.emdbiosciences.com/signalboost</a> <a href="http://www.merck4biosciences.com/signalboost">www.merck4biosciences.com/signalboost</a></td>
</tr>
<tr>
<td>RapidStep&trade; ECL Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD Chemicals/Merck KGaA</td>
<td>345818</td>
<td><a href="http://www.emdbiosciences.com/rapidstep">www.emdbiosciences.com/rapidstep</a> <a href="http://www.merck4biosciences.com/rapidstep">www.merck4biosciences.com/rapidstep</a></td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

western blotting: sample preparation to detection

Вестерн-блоттинга является аналитический метод используется для обнаружения специфических белков в данном образце гомогената ткани или экстракта. Он использует гель-электрофореза для разделения нативных или денатурированных белков длина полипептид (денатурирующих условиях) или 3-D структуры белка (родной / не денатурирующих условиях). Белки затем переведен в мембране (обычно нитроцеллюлозы или PVDF), где их опроса (обнаружен), используя антитела, специфичные к белку-мишени.

Watch this Scientific Journal Video about Western Blotting: Sample Preparation to Detection at JoVE.com

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Вестерн-блоттинга является аналитический метод используется для обнаружения специфических белков в данном образце гомогената ткани или экстракта.

Вестерн-блоттинг: Подготовка образцов для обнаружения

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI пробоподготовки: ультра тонкий слой Метод

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Вестерн-блоттинг Использование Invitrogen NuPage Novex бис Трис MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Протеомный Подготовка образцов из фиксированных формалином и залитых парафином ткани

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

V3 Без пятен рабочий процесс для практического, удобного и надежного тотального контроля загрузки белка в Западном Blotting

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black ...

The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

Самый быстрый Западная в городе: современный поворот на анализ Классический вестерн-блоттинга

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

Руководство по современной количественной Люминесцентная Вестерн-блоттинга с устранения неисправностей стратегий

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

Муцин Электрофорез в агарозном геле: Вестерн блот для высокой молекулярной массой гликопротеинов


Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Подготовка проб для анализа Масс-цитометрии

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Подготовка образцов и изображений Exosomes, просвечивающей электронной микроскопии

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Миниатюрных Пробоподготовка для просвечивающей электронной микроскопии

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...