Name: protocol for production of a genetic cross of the rodent malaria parasites
Uploaded: 2011-01-03T17:30:00
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Wir danken Dr. Randy Elkins, Robin Kastenmayer, Ted Torrey, Dan Pare und Tovi Lehman für die kritische Durchsicht der Manuskripte. Diese Arbeit wurde durch die Interne Research Program der Abteilung für Interne Research, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, und durch das 973 National Basic Research Program of China, # 2007CB513103 unterstützt. Wir danken NIAID intramural Editor Brenda Rae Marshall für die Unterstützung.

Aseptische Technik ist für alle Materialien, die in Tieren verabreicht werden, um eine versehentliche Einführung von exogenen Krankheitserregern in Mäusen, die experimentellen Ergebnisse zu verwechseln vermeiden können angewendet werden. 1. Die Infektion von Mäusen mit Blut-Stufen-Malaria-Erregern <ol><li> Bei Raumtemperatur auftauen zwei Fläschchen mit dem gefrorenen Blut Bühne Malaria-Parasiten zu überqueren. In diesem Beispiel sind zwei Nagetier Malaria-Parasiten Plasmodium-...

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	<li>Hayton, K., Ranford-Cartwright, L. C., Walliker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulfadoxine-pyrimethamine+resistance+in+the+rodent+malaria+parasite+Plasmodium+chabaudi.">Sulfadoxine-pyrimethamine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 2482-2489 (2002).</li><li>Cravo, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+mefloquine+resistance+in+the+rodent+malaria+parasite+Plasmodium+chabaudi.">Genetics of mefloquine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi.</a> Antimicrob Agents Chemother. 47, 709-718 (2003).</li><li>Hunt, P., Cravo, P. V., Donleavy, P., Carlton, J. M., Walliker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroquine+resistance+in+Plasmodium+chabaudi:+are+chloroquine-resistance+transporter+(crt)+and+multi-drug+resistance+(mdr1)+orthologues+involved?.">Chloroquine resistance in Plasmodium chabaudi: are chloroquine-resistance transporter (crt) and multi-drug resistance (mdr1) orthologues involved?.</a> Mol Biochem Parasitol. 133, 27-35 (2004).</li><li>Yuan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mapping+of+targets+mediating+differential+chemical+phenotypes+in+Plasmodium+falciparum.">Genetic mapping of targets mediating differential chemical phenotypes in Plasmodium falciparum.</a> Nat Chem Biol. 5, 765-771 (2009).</li><li>Su, X., Kirkman, L. A., Fujioka, H., Wellems, T. 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J., Carter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenicity+and+genetic+polymorphism+in+cloned+lines+derived+from+a+single+isolate+of+a+rodent+malaria+parasite.">Congenicity and genetic polymorphism in cloned lines derived from a single isolate of a rodent malaria parasite.</a> Mol Biochem Parasitol. 157, 244-247 (2008).</li><li>Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hundreds+of+microsatellites+for+genotyping+Plasmodium+yoelii+parasites.">Hundreds of microsatellites for genotyping Plasmodium yoelii parasites.</a> Mol Biochem Parasitol. 166, 153-158 (2009).</li><li>Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Typing+Plasmodium+yoelii+microsatellites+using+a+simple+and+affordable+fluorescent+labeling+method.">Typing Plasmodium yoelii microsatellites using a simple and affordable fluorescent labeling method.</a> Mol Biochem Parasitol. 155, 94-102 (2007).</li><li>Walliker, D., Carter, R., Morgan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+recombination+in+malaria+parasites.">Genetic recombination in malaria parasites.</a> Nature. 232, 561-562 (1971).</li><li>Sinden, R. 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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+centrifugation+method+for+rapid+separation+of+sporozoites+from+mosquitoes.">Simple centrifugation method for rapid separation of sporozoites from mosquitoes.</a> J Parasitol. 70, 831-833 (1984).</li><li>Yoeli, M., Most, H., Bone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+berghei:+cyclical+transmission+by+experimentally+infected+Anopheles+quadrimachulatus.">Plasmodium berghei: cyclical transmission by experimentally infected Anopheles quadrimachulatus.</a> Science. 144, 1580-1581 (1964).</li><li>Landau, I., Boulard, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Life cycles and Morphology. , (1978).</li><li>Vanderbergh, J. P. 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G. e. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=encoding+erythrocyte+binding+ligand+linked+to+blood+stage+multiplication+rate+phenotype+in+Plasmodium+yoelii+yoelii.">encoding erythrocyte binding ligand linked to blood stage multiplication rate phenotype in Plasmodium yoelii yoelii.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 7161-7166 (2009).</li><li>Pattaradilokrat, S., Cheesman, S. J., Carter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage+group+selection:+towards+identifying+genes+controlling+strain+specific+protective+immunity+in+malaria.">Linkage group selection: towards identifying genes controlling strain specific protective immunity in malaria.</a> PLoS One. 2, e857-e857 (2007).</li><li>Mackinnon, M. J., Read, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Relationships+between+Parasite+Virulence+and+Transmission+in+the+Rodent+Malaria+Plasmodium+chabaudi.">Genetic Relationships between Parasite Virulence and Transmission in the Rodent Malaria Plasmodium chabaudi.</a> Evolution. 53, 689-703 (1999).</li></ol>

Wir zeigen die Techniken für die Herstellung eines genetischen Kreuz in das Nagetier Malaria Plasmodium yoelii, die auch für die Produktion von genetischen Kreuzungen in andere Nager malarias. Infektionen von Mäusen mit einzelnen Eltern Klone sind in der Regel durchgeführt, um eine erfolgreiche Übertragung der elterlichen Parasiten zu bestimmen, um sicherzustellen, dass die Eltern kompetent bei der Herstellung von funktionellen Gameten vor der Durchführung eines Kreuzes sind. ...

Ergänzende Materialien: <ul><li> Wartung von Labormäusen </li><li> Wartung von Labor-Moskitos </li><li> Die mikroskopische Untersuchung von dünnen Blutausstrich mit Giemsa-Färbung </li><li> Die Messung der roten Blutkörperchen Dichte </li></ul> Wartung von Labormäusen Die Weibchen Inzucht Labor Mausstamm BALB / c, im Alter von 5 bis 8 Wochen alt, werden in der Studie verwendet. Mäuse sind in einem Standard mit festem Boden Polycarbonat Käfig mit Draht-bar Deckel, mit Speiser und eine Wasserflasche ausgerüstet untergebracht. Mäuse sind bei einer konstanten Temperatur gehalten (25 ± 1 ° C) auf 12:12 stündigen Licht: Dunkel-Zyklus. Mäuse dürfen auf 2018S Harlan Teklad Globale 19% Protein extrudierten Nagerfutter Feed (sterilisierbar, von Harlan-Teklad) und lieferte mit angesäuertem Trinkwasser ad libitum. Tierversuche sind in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch die Animal Care und Verwenden Ausschuss am National Institute of Allergy and Infectious Disease unter Protokoll LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland) gesetzt durchgeführt. Wartung von Labor-Moskitos Moskitos sind aus einem Labor gezüchtet Kolonie von Anopheles stephensi. Die Erwachsenen sind in Nylon Käfige in einem Temperatur-und Feuchte-kontrollierten Raum (23 bis 25 gehalten ° C gehalten Plasmodium yoelii und Plasmodium chabaudi und 19 bis 21 ° C für Plasmodium berghei; 80 bis 95% Luftfeuchtigkeit; am 00.12 Stunden Licht: Dunkel-Zyklus). Adult Mücken sind mit 10% Glucose und 2,00% para-Aminobenzoesäure (PABA) ergänzt Wasser-Lösung zugeführt. Um qualitativ hochwertige Erwachsene, 500 Larven in einer Low-Density-Zustand in 1 l destilliertem Wasser in einer 1.000-cm 3 offene Schale mit ca. 1 mg Natriumbicarbonat geliefert gewachsen. Nach dem Schlüpfen werden die Larven gegeben TetraMin Pulver (PETCO), bis sie entwickeln sich zu dem Puppenstadium und an die erwachsenen Mücken Käfige für Schwellenländer übertragen. Die mikroskopische Untersuchung von dünnen Blutausstrich mit Giemsa-Färbung Mit sauberen Schere abzuschneiden der Spitze (1,0 mm) der infizierten Maus den Schwanz. Geben Sie einen Tropfen (0,5-1,0 mL) der Schwanz Blut auf ein sauberes Objektträger. Maus stoppt Blutungen in 1-2 min. Legen Sie ein sauberes Streuer schieben auf dem Blutstropfen und hält ihn in einem 45 ° Winkel in Bezug auf den Objektträger und lassen das Blut auf die gesamte Breite des Streuers zu adsorbieren. Halten Sie den Objektträger und voranzutreiben den Streuer schieben schnell und reibungslos zu einem dünnen Abstrich zu produzieren. Lassen Sie das Blut Film trocknen, und dann tauchen die Folien in absolutem Methanol. Lassen Sie die Folie an der Luft trocknen noch einmal vor dem Abdecken mit Giemsa (10% Giemsa Farbstoff in destilliertem Wasser). Nach der Inkubation das dünne Blut Filme für 10-15 min bei Raumtemperatur sorgfältig spülen Sie die Dias mit Leitungswasser und lassen Sie sie trocknen. Untersuchen Sie die Anzahl der infizierten roten Blutkörperchen (iRBC; siehe Abbildung 3 für die Morphologie der infizierten Erythrozyten) unter einem Lichtmikroskop mit Immersionsöl bei 1000-facher Vergrößerung (100x mit Objektiv) und berechnen Parasitämie (die Anzahl der iRBC pro 100 RBC gezählt). Verschiedene Stämme von Malariaparasiten variieren in der Wachstumsrate und Pathogenität. Überwachung von Blut Bühne Parasitämien durchgeführt 24h nach Injektionen, abhängig von der Dosis des Blutes Bühne Malaria-Parasiten. Zum Beispiel werden die Mäuse mikroskopisch positive 24 Uhr werden, wenn sie mit 10 7 infiziert RBC intraperitoneal oder 10 6 infizierten RBC intravenös injiziert. Die Messung der roten Blutkörperchen Dichte Wie die Ebenen der Parasitämien, roten Blutkörperchen (RBC) Dichte in infizierten Mäusen variiert im Verlauf der Infektion. RBC Dichte sollte innerhalb von 1-2 Stunden vor dem Start des Einzel-und Mixed-Klon-Infektion und das Klonen Experimenten gemessen werden. Es gibt zwei Methoden für die Messung der RBC Dichte: ein manuelles Zählen mit Neubauer-Zählkammer und eine automatische Zählung mit einem Cellometer (Nexcelom Bioscience). Bei beiden Methoden sind je 1 ul der Maus Schwanz Blut mit einer Glaskapillare (VWR) und verdünnen in 10 ml PBS und gut mischen. Für die Verwendung einer Neubauer-Zählkammer, Last 20 ul der Suspension auf die Hämazytometer. Legen Sie die Hämazytometer auf einem Lichtmikroskop mit 10x Objektiv. Die Hämazytometer enthält ein Raster in 9 große Quadrate und 4 große Quadrate an den Ecken gegliedert werden weiter in 16 kleine Quadrate unterteilt. Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen in jeder der 16 kleine Quadrate in den vier Eck-Quadraten. Um zu vermeiden, Zählen Bias oder Zählen von Zellen, die ein Raster Linie überschneiden, gehören eine Zelle als &quot;in&quot;, ob er sich der rechten oder oberen Linien und &quot;out&quot;, ob er sich unten oder links Linien. Schätzen Sie die Anzahl der Zellen pro ein kleines Quadrat und dividieren durch 0,00625 (das Volumen eines kleinen Platz beträgt 6,25 nL). Daraus ergibt sich die Anzahl der Zellen pro Mikroliter (&amp;mu; L). Aus diesen Daten berechnet den endgültigen roten Blutkörperchen Dichte durch Multiplikation mit 10.000 (ein Verdünnungsfaktor). Spülen Sie das Deckglas und Zählkammer mit destilliertem Wasser und 70% Ethanol, an der Luft trocknen. Alternativ laden 20 ul der Suspension auf einen Cellometer Zählkammer gleiten. Legen Sie die Folie in einen Cellometer schieben Kammer (dem Leser). Starten Sie den Cellometer Software, wählen Sie den &quot;roten Blutkörperchen&quot;-Option, und geben Sie einen Verdünnungsfaktor von 10.000. Notieren Sie sich die RBC Dichte.

protocol for production of a genetic cross of the rodent malaria parasites

Variation in Reaktion auf Medikamente gegen Malaria und Pathogenität von Malaria-Parasiten ist von biologischen und medizinischen Bedeutung. Linkage Mapping um erfolgreiche Identifizierung von Genen oder loci zugrunde liegenden verschiedenen Eigenschaften in Malaria-Parasiten von Nagetieren 1-3 und 4-6 Menschen geführt. Die Malaria-Parasiten Plasmodium yoelii ist eine von vielen Malaria-Arten von wilden afrikanischen Nagetieren isoliert und wurde angepasst, um im Labor wachsen. Diese Art reproduziert viele der biologischen Eigenschaften des menschlichen Malaria-Parasiten, genetischen Markern wie Mikrosatelliten und amplifizierte Fragment-Längen-Polymorphismus (AFLP)-Marker sind auch für die Parasiten 7-9 entwickelt worden. So können genetische Untersuchungen bei Nagetieren Malaria-Parasiten durchgeführt, um Forschung auf Plasmodium falciparum ergänzen. Hier zeigen wir die Techniken zur Herstellung eines genetischen Kreuz in P. yoelii, die zuerst Pionierarbeit von Dr. wurden. David Walliker, Richard Carter und Kollegen an der University of Edinburgh 10. Genetische Kreuze in P. yoelii und andere Nager Malaria-Parasiten sind durch Infizieren Mäusen Mus musculus mit einem Inokulum mit gametocytes von zwei genetisch unterschiedliche Klone, die in Phänotypen von Interesse und indem Mücken auf dem infizierten Mäusen 4 Tage nach der Infektion Vorschub unterscheiden durchgeführt. Die Anwesenheit von männlichen und weiblichen gametocytes in der Maus Blut mikroskopisch vor der Fütterung bestätigt. Innerhalb von 48 Stunden nach der Fütterung, im Mitteldarm der Mücke, die haploid gametocytes in männliche und weibliche Keimzellen zu differenzieren, zu befruchten, und bilden eine diploide Zygote (Abb. 1). Bei der Entwicklung einer Zygote in eine ookinete erscheint Meiose bis 11 auftreten. Wenn die Zygote durch gegenseitige Befruchtung zwischen Gameten von zwei genetisch verschiedene Parasiten, genetischen Austausch (. Chromosomale Reassortierung und Cross-overs zwischen den Nicht-Schwesterchromatiden eines Paares von homologen Chromosomen; Abb. 2) abgeleitet sind, können auftreten, die bei der Rekombination von genetischem Material an homologen Loci. Jede Zygote durchläuft zwei aufeinanderfolgende Kernteilungen, was zu vier haploide Kerne. Ein ookinete weiterentwickelt in eine Oozysten. Sobald die Oozysten fällig wird, werden Tausende von Sporozoiten (die Nachkommen des Kreuzes) gebildet und freigesetzt in Mücke hemoceal. Sporozoiten aus den Speicheldrüsen geerntet und in eine neue Maus-Host, wo pre-Erythrozyten und Erythrozyten Entwicklungsphase stattfindet. Erythrozytären Formen sind geklont und klassifiziert in Bezug auf die Charaktere zu unterscheiden elterlichen Linien vor genetische Verknüpfung Mapping. Bekämpfung von Infektionen von einzelnen Eltern Klone sind in der gleichen Weise wie die Herstellung eines genetischen Kreuz durchgeführt.

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Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Genetische Kreuzungen Nagetier Malaria-Parasiten werden durch Zuführen von zwei genetisch verschiedene Parasiten Mücken durchgeführt. Rekombinante Nachkommen sind von der Maus Blut nach Abzug Mücken infizierten Mäuse beißen geklont. Dieses Video zeigt, wie genetische Kreuzungen produzieren<em&gt; Plasmodium yoelii</em&gt; Und ist auch für andere Nager Malaria-Parasiten.

Protokoll für die Herstellung eines genetischen Kreuz der Nager Malaria-Erregern

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

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Forschung

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