Name: protocol for production of a genetic cross of the rodent malaria parasites
Uploaded: 2011-01-03T17:30:00
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私たちは、原稿の重要な読書のために、博士ランディエルキンズ、ロビンKastenmayer、テッドトーリー、ダンパレとToviリーマンに感謝。この作品は、＃2007CB513103、学内研究の部門の学内研究プログラム、アレルギーや国立感染症研究所、国立衛生研究所によって、中国の973国家基礎研究プログラムによってサポートされていました。我々は援助のためにNIAID学内エディタブレンダレイマーシャルに感謝。

無菌技術は、実験結果を混乱させることができるマウスに外因性の感染性病原体の不注意な導入を避けるために動物に投与されるすべての材料に適用する必要があります。 1。血液ステージマラリア原虫を持つ実験用マウスの感染症<ol><li>室温で、交差する冷凍血液ステージマラリア原虫を含む二つのバイアルを解凍。この例では、使用される2つのげっ歯類のマラリア?...

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	<li>Hayton, K., Ranford-Cartwright, L. C., Walliker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulfadoxine-pyrimethamine+resistance+in+the+rodent+malaria+parasite+Plasmodium+chabaudi.">Sulfadoxine-pyrimethamine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 2482-2489 (2002).</li><li>Cravo, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+mefloquine+resistance+in+the+rodent+malaria+parasite+Plasmodium+chabaudi.">Genetics of mefloquine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi.</a> Antimicrob Agents Chemother. 47, 709-718 (2003).</li><li>Hunt, P., Cravo, P. V., Donleavy, P., Carlton, J. 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J., Carter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenicity+and+genetic+polymorphism+in+cloned+lines+derived+from+a+single+isolate+of+a+rodent+malaria+parasite.">Congenicity and genetic polymorphism in cloned lines derived from a single isolate of a rodent malaria parasite.</a> Mol Biochem Parasitol. 157, 244-247 (2008).</li><li>Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hundreds+of+microsatellites+for+genotyping+Plasmodium+yoelii+parasites.">Hundreds of microsatellites for genotyping Plasmodium yoelii parasites.</a> Mol Biochem Parasitol. 166, 153-158 (2009).</li><li>Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Typing+Plasmodium+yoelii+microsatellites+using+a+simple+and+affordable+fluorescent+labeling+method.">Typing Plasmodium yoelii microsatellites using a simple and affordable fluorescent labeling method.</a> Mol Biochem Parasitol. 155, 94-102 (2007).</li><li>Walliker, D., Carter, R., Morgan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+recombination+in+malaria+parasites.">Genetic recombination in malaria parasites.</a> Nature. 232, 561-562 (1971).</li><li>Sinden, R. 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G. e. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=encoding+erythrocyte+binding+ligand+linked+to+blood+stage+multiplication+rate+phenotype+in+Plasmodium+yoelii+yoelii.">encoding erythrocyte binding ligand linked to blood stage multiplication rate phenotype in Plasmodium yoelii yoelii.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 7161-7166 (2009).</li><li>Pattaradilokrat, S., Cheesman, S. J., Carter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage+group+selection:+towards+identifying+genes+controlling+strain+specific+protective+immunity+in+malaria.">Linkage group selection: towards identifying genes controlling strain specific protective immunity in malaria.</a> PLoS One. 2, e857-e857 (2007).</li><li>Mackinnon, M. J., Read, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Relationships+between+Parasite+Virulence+and+Transmission+in+the+Rodent+Malaria+Plasmodium+chabaudi.">Genetic Relationships between Parasite Virulence and Transmission in the Rodent Malaria Plasmodium chabaudi.</a> Evolution. 53, 689-703 (1999).</li></ol>

我々はまた、他のげっ歯類malariasの遺伝的交雑の製造に適用可能である齧歯類マラリア原虫yoelii、の遺伝的交雑の生産のための手法を示します。単一の親のクローンを持つマウスの感染は通常、親がクロスを実行する前に、機能的な配偶子の生産で有能であることを保証するために親の寄生虫の転送に成功したことを判断するために実行されます。 蚊を介して転送...

補足資料： <ul><li>実験用マウスのメンテナンス</li><li>実験室蚊のメンテナンス</li><li>染色ギムザで染色薄い血液塗抹標本の顕微鏡検査</li><li>赤血球の細胞密度の測定</li></ul>実験用マウスのメンテナンス 5〜8週齢歳の近交系実験用マウス系統BALB / cの雌は、試験で使用されています。マウスは、フィーダーと水のボトルを装備したワイヤーバー蓋付きの標準のソリッドボトムポリカーボネートケージに収容されています。暗サイクル：マウスは、12：12時間光で一定温度（25 ± 1℃）で維持されています。 （滅菌、ハーラン- Tekladから）マウスは、2018SハーランTekladグローバル19％の蛋白質押出齧歯類の食事を食べに許可され、酸性の飲料水を自由に摂取が付属。動物実験はプロトコルLMVR11E（健康、ベセスダ、メリーランド州の国立研究所）の下でアレルギー感染症研究所における動物実験委員会が定めるガイドラインおよび規則に従って実行されます。 実験室蚊のメンテナンス蚊は、ハマダラカの実験室育ちのコロニーからです。 12：12で、80から95パーセント湿度、大人の温度および湿度調整室（23〜25℃ マラリアyoeliiとマラリアchabaudi用C、および21 to 19 ° マラリアbergheiためのCに保持されているナイロンケージの中で維持される時間の光：明暗サイクル）。大人の蚊は、10％グルコースと2.00％のパラ - アミノ安息香酸（PABA）を補充水溶液を供給している。高品質の大人を取得するには、500幼虫は、炭酸水素ナトリウムの約1 mgに付属の1,000 cm 3のオープン皿に蒸留水1 Lの低密度条件で栽培されています。彼らは蛹の段階へと発展し、新興のための大人の蚊のケージに転送されるまで孵化した後、幼虫はtetramin粉（PETCO）が与えられます。 染色ギムザで染色薄い血液塗抹標本の顕微鏡検査使用してきれいなハサミは、感染したマウスの尾の先端（1.0 mm）をチョキンと切る。きれいな標本スライド上に尾の血の一滴（0.5〜1.0μL）を置きます。マウスは1〜2分で出血を止めるでしょう。標本のスライドに45 °の角度の相対でそれを維持し、血の滴の上にきれいなスプレッダーのスライドを配置し、そして血液がスプレッダーの幅全体に吸着することができます。標本のスライドをホールドし、薄層塗抹標本を生成するために迅速かつ円滑にスプレッダーのスライドを前方に押してください。絶対メタノールにスライドを浸漬し、血液のフィルムは乾燥させて、と。スライドが染色ギムザ（蒸留水で10％ギムザ染色）でそれを覆う前に、もう一度風乾します。室温で10〜15分間血液を薄める膜をインキュベートした後、慎重に水道水でスライドを洗浄して空気を乾燥させる。 1000X倍率（100倍対物レンズ付）と計算寄生虫（RBCはカウント100台iRBCの数）で液浸油と光顕微鏡下で、感染した赤血球（感染した赤血球の形態は図3を参照iRBC）の数を調べます。マラリア原虫の異なる株は、成長率と病原性に変化する。血液ステージparasitaemiasの監視は、血液ステージマラリア原虫の投与量に応じて、注射後24時間行うことができます。 10 7感染RBC腹腔内または静脈内投与10 6感染した赤血球を注射したとき、例えば、マウスは、顕微鏡的に正の24時間になります。 赤血球の細胞密度の測定 parasitaemias、感染マウスの赤血球（RBC）の密度のレベルのような感染の経過を通じて変化する。 RBCの密度は、シングルおよびミックスドクローン感染とクローニング実験の開始前に1〜2時間以内に測定する必要があります。 Cellometerを使用してノイ血球計数器と自動計数（Nexcelomバイオサイエンス）を用いてマニュアルカウント：RBCの密度の測定のための2つの方法があります。両方の方法では、ガラスキャピラリーを用いて、マウスの尾の血の1μL（VWR）を撤回し、PBS 10mLに希釈し、よく混ぜる。ノイバウアーの血球計を使用するには、血球計算盤の上に懸濁液20μLをロードする。 10倍対物レンズと光学顕微鏡で血球計を置きます。血球計算盤は9大の正方形に分割し、グリッドが含まれており、コーナーの4大マスはさらに16の小さな正方形に分割されます。四隅の正方形の16の小さな正方形のそれぞれのセルの合計数をカウントします。バイアスを数えたり、グリッド線に重なるセルをカウントを避けるために、&quot;内&quot;としてセルをカウントし、それが重なっている上または右の線と&quot;アウト&quot;が重なる下部または左の行をした場合。一つの小さな正方形当たりの細胞数を推定し、0.00625（つの小さな正方形の体積は6.25 NLです）で割ります。これは、マイクロリットル当たりの細胞数が得られます（＆ミュー、L）。このデータから、10,000（希釈倍率）を乗じて最終的な赤血球の密度を計算する。空気乾燥し、蒸留水と70％エタノールでカバースリップとカウントチャンバーを洗浄します。また、Cellometerカウントのチャンバースライド上に懸濁液20μLをロードする。 Cellometerスライドチャンバー（リーダー）にスライドを挿入します。 Cellometerソフトウェアを起動し、&quot;赤血球&quot;オプションを選択し、10,000の希釈率を入力します。 RBCの密度を記録します。

protocol for production of a genetic cross of the rodent malaria parasites

抗マラリア薬への応答で、マラリア原虫の病原性の変化は、生物学的および医学的に重要である。リンケージマッピングは4-6 1-3およびヒトのげっ歯類のマラリア原虫の様々な特性の基礎となる遺伝子または遺伝子座の同定に成功につながっている。マラリア原虫yoeliiは野生のアフリカのげっ歯類から分離された多くのマラリアの種の一つであり、実験室で成長するように適応されています。この種は、人間のマラリア原虫の生物学的特性の多くを再現し、そのようなマイクロサテライトや増幅断片長多型（AFLP）マーカーなどの遺伝子マーカーはまた、寄生虫7月9日のために開発されている。従って、げっ歯類のマラリア原虫の遺伝学的研究は、 熱帯熱マラリア原虫の研究を補完するために実行することができます。ここで、我々は、P.の遺伝的交雑を生成するための手法を示します第一博士によって開拓されたyoelii。デビッドWalliker、リチャードカーター、そしてエディンバラ10の大学の同僚。 P.の遺伝的交雑yoeliiと他のげっ歯類のマラリア原虫は、関心の表現型と蚊は4日、感染後に感染したマウスを餌にできるため、異なる2つの遺伝的に異なるクローンのgametocytesを含む接種でマウスのハツカネズミを感染させることによって行われます。マウスの血液中の男性と女性gametocytesの有無を顕微鏡供給する前に確認されている。授乳後48時間以内に、蚊の中腸では、半数体gametocytesは、​​男性と女性の配偶子に分化受精させる、と二倍体の接合子（図1）を形成する。オーキネートへの受精卵の開発中に、減数分裂は11を発生することが表示されます。受精卵は、2つの遺伝的に異なる寄生虫、遺伝的交流（。相同染色体のペアの非姉妹染色分体の間に染色体の再集合し、クロスオーバー、図2）の配偶子間のクロス受精によって派生している場合は、組換えの結果、発生する可能性があります。相同遺伝子座の遺伝物質の。それぞれの接合子は、4倍体の核につながる、二つの連続核分裂を起こす。オーキネートはさらにオーシストに開発しています。オーシストが成熟したら、スポロゾイト（クロスの子孫）の数千人が形成され、蚊のhemocealに放出されています。スポロゾイトが唾液腺から採取し、前赤血球と赤血球ステージの開発が行われる新しいマウス宿主に注入されています。赤血球の形態はクローニングと遺伝子連鎖地図作成の前に親の行を区別する文字に関して分類されます。個々の親のクローンの制御の感染症は、遺伝的交雑の生産と同じ方法で実行されます。

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Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

げっ歯類のマラリア原虫の遺伝学的交配は蚊に2つの遺伝的に異なる寄生虫を供給することによって実行されます。組換え子孫は、蚊が感染したマウスを噛まないようにできるようにした後、マウスの血液からクローン化されています。このビデオでは、遺伝的交雑を生成する方法を示しています。<em&gt;マラリアyoelii</em&gt;と他のげっ歯類のマラリア原虫に適用可能である。

げっ歯類のマラリア原虫の遺伝的交雑の生産のためのプロトコル

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

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ライブホストのトランスジェニックリーシュマニア原虫のin vivoイメージング

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黄熱病の蚊から血球を収集し、染色のためのプロトコルネッタイシマカ</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

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Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

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Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

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Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

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生体外でマウスのナチュラル キラー細胞の大量生産のため新規無料の送り装置システム

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