Name: protocol for production of a genetic cross of the rodent malaria parasites
Uploaded: 2011-01-03T17:30:00
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우리는 원고의 중요한 읽기위한 DRS 랜디 엘킨스, 로빈 Kastenmayer, 테드 토리, 댄 정지 및 Tovi 리먼 감사드립니다. 이 작품은 교내 연구 부문의 교내 연구 프로그램, 알레르기 및 전염병, 보건 국립 연구소 국립 연구소에 의해 중국의 973 국가 기초 연구 프로그램, # 2007CB513103에 의해 지원되었다. 우리는 도움을 NIAID 교내 편집기 브렌다 라에 마샬 감사합니다.

무균 기술은 실험 결과를 혼란시킬 수있는 마우스로 외인성 감염 요원의 실수로 도입을 피하기 위해 동물로 administrated 될 모든 재료에 적용해야합니다. 1. 피를 단계 말라리아 기생충과 실험실 쥐를 감염 <ol><li> 상온에서, 냉동 혈액 단계 말라리아 기생충을 포함하는 두 병이 깨지는 해동. 이 예제에서 사용이 쥐 말라리아 기생충의 종자는 Plasmodium yoelii yoelii 및 Plas...

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	<li>Hayton, K., Ranford-Cartwright, L. C., Walliker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulfadoxine-pyrimethamine+resistance+in+the+rodent+malaria+parasite+Plasmodium+chabaudi.">Sulfadoxine-pyrimethamine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 2482-2489 (2002).</li><li>Cravo, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+mefloquine+resistance+in+the+rodent+malaria+parasite+Plasmodium+chabaudi.">Genetics of mefloquine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi.</a> Antimicrob Agents Chemother. 47, 709-718 (2003).</li><li>Hunt, P., Cravo, P. V., Donleavy, P., Carlton, J. M., Walliker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroquine+resistance+in+Plasmodium+chabaudi:+are+chloroquine-resistance+transporter+(crt)+and+multi-drug+resistance+(mdr1)+orthologues+involved?.">Chloroquine resistance in Plasmodium chabaudi: are chloroquine-resistance transporter (crt) and multi-drug resistance (mdr1) orthologues involved?.</a> Mol Biochem Parasitol. 133, 27-35 (2004).</li><li>Yuan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mapping+of+targets+mediating+differential+chemical+phenotypes+in+Plasmodium+falciparum.">Genetic mapping of targets mediating differential chemical phenotypes in Plasmodium falciparum.</a> Nat Chem Biol. 5, 765-771 (2009).</li><li>Su, X., Kirkman, L. A., Fujioka, H., Wellems, T. 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G. e. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=encoding+erythrocyte+binding+ligand+linked+to+blood+stage+multiplication+rate+phenotype+in+Plasmodium+yoelii+yoelii.">encoding erythrocyte binding ligand linked to blood stage multiplication rate phenotype in Plasmodium yoelii yoelii.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 7161-7166 (2009).</li><li>Pattaradilokrat, S., Cheesman, S. J., Carter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage+group+selection:+towards+identifying+genes+controlling+strain+specific+protective+immunity+in+malaria.">Linkage group selection: towards identifying genes controlling strain specific protective immunity in malaria.</a> PLoS One. 2, e857-e857 (2007).</li><li>Mackinnon, M. J., Read, A. 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우리는 또한 다른 쥐 malarias의 유전 십자가의 생산에 적용되는 설치류 말라리아 Plasmodium yoelii에서 유전자 십자가의 생산을위한 기술을 보여줍니다. 단일 클론 부모와 생쥐의 감염은 대개 부모가 십자가를 수행하기 전에 기능 gametes를 생산 능력이 있는지 확인하는 부모 기생충의 성공적인 전송을 결정하기 위해 수행됩니다. 모기를 통해 성공적인 전송이 insectary의 온도...

보충 자료 : <ul><li> 실험실 생쥐들의 유지 보수 </li><li> 연구실 모기 유지 </li><li> Giemsa 물들다 얇은 피묻은 얼룩의 현미경 검사는 얼룩 </li><li> 붉은 혈액 세포 밀도의 측정 </li></ul> 실험실 생쥐들의 유지 보수 근친 실험실 마우스 스트레인 5~8주 오래된 세 BALB / C,의 여성이 연구에 사용됩니다. 마우스는 피더와 물통을 갖춘 와이어 바 뚜껑이있는 표준 솔리드 하단에 폴리 카보 네이트 케이지에 보관되어 있습니다. 마우스가 일정한 온도 유지 (25 ± 1 ° C) 12시 12분 시간에 조명 : 어두운주기. (sterilizable, 할란 - Teklad에서) 생쥐 2018S 할런 Teklad 글로벌 19 % 단백질 압출 쥐 다이어트 피드를 허용하고 산성의 식수 광고 libitum와 함께 제공된. 동물 실험 프로토콜 LMVR11E (건강, 베데스다, 메릴랜드 국립 연구소)에서 알레르기 및 전염병 국립 연구소에서 동물 케어 및 사용위원회에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행됩니다. 연구실 모기 유지 아노 펠 레스 모기 stephensi의 실험실에서 자란 식민지에서 있습니다. 성인은 온도 및 습도 제어 방 (25 23 보관 나일론 새장에 유지됩니다 ° Plasmodium yoelii 및 Plasmodium chabaudi에 대한 C, 21 to 19 ° Plasmodium berghei에 대한 C, 80~95% 습도; 12시 12분에 시간 라이트 : 어두운 사이클). 성인 모기가 10 % 포도당과 2.00 % 파라 아미노 벤의 산성 (PABA) 보충 물 솔루션을 공급하고 있습니다. 고품질의 성인을 얻으려면, 500 애벌레는 중탄산 약 1 MG와 함께 제공되는 1000 cm 3 열 접시에 증류수 1 L에 낮은 밀도 상태로 재배하고 있습니다. 그들은 번데기 단계로 발전하기 전까지 부화 후 유충은 tetramin 분말 (페트코에게) 부여되고 신흥위한 성인 모기 케이지으로 전송됩니다. Giemsa 물들다 얇은 피묻은 얼룩의 현미경 검사는 얼룩 를 사용하여 깨끗한 가위는 감염된 마우스의 꼬리의 끝 (1.0 mm)를 해제 싹둑. 깨끗한 표본 슬라이드에 꼬리 혈액 플레이스 한방울 (0.5-1.0 μL). 마우스 1-2 분에 출혈이 중단됩니다. 표본 슬라이드에 45 ° 각도로 상대에 그것을 유지, 혈액 드롭 위에 깨끗한 확장기가 슬라이드를 삽입하고, 혈액이 확장기의 전체 너비 adsorb 수 있습니다. 표본 슬라이드를 잡고 얇은 얼룩을 만들어 빠르게하고 원활하게 전달 확장기 슬라이드를 밀어. 절대 메탄올에 슬라이드를 담가 후 혈액 영화 건조 해합니다. Giemsa 얼룩 (증류수에서 10 % Giemsa 염색)로 덮는 전에 한 번 더 건조 공기에 슬라이드를 허용합니다. 실온에서 10-15 분 얇은 혈액 영화를 잠복기 후, 신중하게 수돗물로 슬라이드를 씻어하고 공기가 건조 보자. 1000x 배율 (100x 객관적인 렌즈)와 계산 parasitemia (RBC는 계산 100 당 iRBC의 숫자)에 침지 기름 가벼운 현미경, 감염된 적혈구 (감염된 RBC의 형태에 대한 그림 3 참조 iRBC)의 번호를 확인합니다. 말라리아 기생충의 다른 변종 성장 속도와 pathogenicity에 따라 다릅니다. 혈액 무대 parasitaemias의 모니터링은 혈액 단계 말라리아 기생충의 복용량에 따라 주사 후 24 시간 수행할 수 있습니다. 10 7 감염된 RBC intraperitoneally 또는 정맥 10 6 감염된 RBC와 함께 주입하면 예를 들어, 마우스가 미세하게 긍정적인 24 시간 것입니다. 붉은 혈액 세포 밀도의 측정 parasitaemias, 감염된 생쥐의 적혈구 세포 (RBC) 밀도의 수준과 같은 감염의 과정에 걸쳐 다릅니다. RBC 밀도는 단일 및 혼합 복제 감염의 시작과 복제 실험을하기 전에 1-2 시간 이내에 측정한다. Cellometer를 사용하여 노이 바 우어 hemocytometer 및 자동 계산 (Nexcelom Bioscience)를 사용하여 수동으로 계수 : RBC 밀도 측정을위한 두 가지 방법이 있습니다. 두 방법에서는 모세관 유리 (VWR)를 사용하여 마우스 꼬리 혈액 1 μL를 철회하고 PBS의 10 ML에 희석하여 잘 섞는다. 노이 바 우어의 hemocytometer를 사용하려면 hemacytometer에 정지 20 μL를로드합니다. 10X 객관적인 렌즈와 가벼운 현미경에 hemacytometer 놓으십시오. hemacytometer 추가 16 작은 사각형으로 나뉩니다 9 큰 사각형과 모서리에 4 큰 사각형으로 나누어 그리드가 포함되어 있습니다. 네 개의 코너 광장에서 16 작은 사각형의 각 세포의 총 수를 계산합니다. 바이어스를 계산하거나 그리드 라인을 중첩 셀을 계산하지 않으려면, &quot;에&quot;로 셀 계산이 중복하는 경우 상단 또는 오른쪽 라인과 &quot;아웃&quot;이 중복 아래쪽이나 왼쪽 라인을 경우. 작은 평방 당 세포의 숫자를 추정하고 0.00625 (작은 사각형의 볼륨이 6.25 NL이다)로 나눕니다. 이것은 microliter 당 세포 (&amp;의 개수를 산출무, L). 이 데이터에서 10,000 (희석 계수)과 곱하여 최종 적혈구 세포 밀도를 계산합니다. 공기 건조, 증류수와 70 % 에탄올로 커버 슬립과 집계 실 린스. 또는 Cellometer의 계수 챔버 슬라이드에 정지 20 μL를로드합니다. Cellometer 슬라이드 챔버 (독자)에 슬라이드를 삽입합니다. , Cellometer 소프트웨어를 시작하고 &quot;적혈구 세포&quot;옵션을 선택하고, 10,000 희석 요소를 입력합니다. RBC 밀도를 기록합니다.

protocol for production of a genetic cross of the rodent malaria parasites

antimalarial 약물에 대한 응답과 말라리아 기생충의 pathogenicity의 변화는 생물 학적 및 의료 중요하다. 연계 매핑 1-3 설치류와 인간의 4-6 말라리아 기생충의 다양한 특성을 기본 유전자 또는 loci 성공적으로 확인되었다. 말라리아 기생충 Plasmodium yoelii 야생 아프리카 설치류로부터 분리된 많은 말라리아 종 중 하나이며 실험실에서 성장에 적응되었습니다. 이 종족은 인간의 말라리아 기생충의 생물 학적 특성 중 많은 것들을 재현한, 같은 microsatellite 및 증폭 단편의 길이 다형성 (AFLP) 마커와 같은 유전자 마커 또한 기생충 7-9 위해 개발되었습니다. 따라서, 쥐 말라리아 기생충의 유전자 연구는 Plasmodium falciparum에 대한 연구를 보완하기 위해 수행할 수 있습니다. 여기, 우리는 P.의 유전 십자가를 생산을위한 기술을 보여줍니다 첫째 DRS에 의해 개척되었다 yoelii. 데이비드 Walliker, 리차드 카터와 에딘버러 (Edinburgh) 10 대학에서 동료. P.의 유전 십자가 yoelii 및 기타 설치류의 말라리아 기생충은 관심의 phenotypes와 모기가 사일 감염 후 감염된 생쥐에서 피드 수에 따라 다릅니다 두 유전자 별개의 클론의 gametocytes를 포함 inoculum와 쥐 뮤스의 musculus를 감염에 의해 실시하고 있습니다. 마우스 혈액에서 남성과 여성 gametocytes의 존재는 미세 이송하기 전에 확인합니다. 수유 후 48 시간 이내에 모기의 midgut에서 haploid gametocytes은 남성과 여성의 gametes에 차별 비옥하고, diploid의 접합자 (그림 1) 형태. ookinete에 접합자의 개발 과정, 감수 분열 11 발생 나타납니다. 접합자는 두 유전자 별개의 기생충, 유전자 교류 (. 상동 염색체의 쌍 비 자매 chromatids 사이의 염색체 reassortment 상호 오버, 그림 2) gametes 사이의 교차 수정을 통해 파생하는 경우는 재조합의 결과가 발생할 수 있습니다 동종 loci에서 유전 물질. 각 접합자 네 haploid의 핵 이어지는 두 개의 연속 핵 분열을 겪습. ookinete 추가 oocyst으로 개발하고 있습니다. oocyst가 성숙되면, sporozoites (십자가의 자손)의 수천이 형성 및 모기 hemoceal로 출시됩니다. Sporozoites는 침샘에서 수확 및 사전 erythrocytic 및 erythrocytic 단계 개발이 이루어지는 새로운 murine 호스트로 주입됩니다. Erythrocytic 양식은 복제와 유전 결합 매핑하기 전에 부모의 라인을 구분 문자에 관한 분류됩니다. 개별 부모 클론 제어 감염은 유전 십자가의 생산과 같은 방식으로 수행됩니다.

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Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

쥐 말라리아 기생충의 유전자 십자가는 모기에 두 유전자 별개의 기생충을 먹이에 의해 수행됩니다. 재조합 자손은 모기가 감염된 쥐를 물어 수 있도록 후 마우스 혈액에서 복제됩니다. 이 비디오의 유전자 십자가를 생산하는 방법을 보여줍니다<em&gt; Plasmodium yoelii</em&gt; 기타 설치류의 말라리아 기생충에 적용됩니다.

쥐 말라리아 기생충의 유전자 크로스의 생산을위한 프로토콜

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

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라이브 호스트에 트렌스 제닉 Leishmania의 기생충의 생체내 이미징에서

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

연구

면역학 및 감염병학

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

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옐로 피버 모스키토에서 Hemocytes를 수집 및 스테 이닝을위한 프로토콜 Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

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에서 DNA 추출을위한 간단한 Chelex 프로토콜<em&gt; 아노펠레스</em&gt; 종.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

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Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

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Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

B 임파 세포 라인의 설립에 대한 간단한 적혈구 용해 방법

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

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A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

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Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

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대 식 세포 안의 세포내 성장의 정량화는 빠르고 Leishmania 기생충의 독성을 평가 하기 위한 신뢰할 수 있는 방법

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

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선생님 FcγR Cross-linking에 대 식 세포에서 생산의 흐름 Cytometric 측정

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