Name: protocol for production of a genetic cross of the rodent malaria parasites
Uploaded: 2011-01-03T17:30:00
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Agradecemos Drs. Randy Elkins, Robin Kastenmayer, Ted Torrey, Dan Pare e Tovi Lehman para a leitura crítica dos manuscritos. Este trabalho foi financiado pelo Programa de Pesquisa Intramural da Divisão de Pesquisa intramuros, Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas, dos Institutos Nacionais de Saúde e pelo Programa Nacional de Pesquisa 973 Básico da China, # 2007CB513103. Agradecemos a NIAID intramural editor Brenda Rae Marshall para a assistência.

Técnicas de assepsia devem ser aplicados a todos os materiais que serão administrados em animais para evitar a introdução inadvertida de agentes infecciosos exógenos em camundongos que podem confundir os resultados experimentais. 1. Infecção de ratos de laboratório com sangue Parasitas estágio Malária <ol><li> À temperatura ambiente, descongelar dois frascos contendo o sangue congelado parasitas da malária etapa a ser atravessada. Neste exemplo, duas cepas de roedores parasita ...

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	<li>Hayton, K., Ranford-Cartwright, L. C., Walliker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulfadoxine-pyrimethamine+resistance+in+the+rodent+malaria+parasite+Plasmodium+chabaudi.">Sulfadoxine-pyrimethamine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 2482-2489 (2002).</li><li>Cravo, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+mefloquine+resistance+in+the+rodent+malaria+parasite+Plasmodium+chabaudi.">Genetics of mefloquine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi.</a> Antimicrob Agents Chemother. 47, 709-718 (2003).</li><li>Hunt, P., Cravo, P. V., Donleavy, P., Carlton, J. M., Walliker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroquine+resistance+in+Plasmodium+chabaudi:+are+chloroquine-resistance+transporter+(crt)+and+multi-drug+resistance+(mdr1)+orthologues+involved?.">Chloroquine resistance in Plasmodium chabaudi: are chloroquine-resistance transporter (crt) and multi-drug resistance (mdr1) orthologues involved?.</a> Mol Biochem Parasitol. 133, 27-35 (2004).</li><li>Yuan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mapping+of+targets+mediating+differential+chemical+phenotypes+in+Plasmodium+falciparum.">Genetic mapping of targets mediating differential chemical phenotypes in Plasmodium falciparum.</a> Nat Chem Biol. 5, 765-771 (2009).</li><li>Su, X., Kirkman, L. A., Fujioka, H., Wellems, T. 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J., Carter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenicity+and+genetic+polymorphism+in+cloned+lines+derived+from+a+single+isolate+of+a+rodent+malaria+parasite.">Congenicity and genetic polymorphism in cloned lines derived from a single isolate of a rodent malaria parasite.</a> Mol Biochem Parasitol. 157, 244-247 (2008).</li><li>Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hundreds+of+microsatellites+for+genotyping+Plasmodium+yoelii+parasites.">Hundreds of microsatellites for genotyping Plasmodium yoelii parasites.</a> Mol Biochem Parasitol. 166, 153-158 (2009).</li><li>Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Typing+Plasmodium+yoelii+microsatellites+using+a+simple+and+affordable+fluorescent+labeling+method.">Typing Plasmodium yoelii microsatellites using a simple and affordable fluorescent labeling method.</a> Mol Biochem Parasitol. 155, 94-102 (2007).</li><li>Walliker, D., Carter, R., Morgan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+recombination+in+malaria+parasites.">Genetic recombination in malaria parasites.</a> Nature. 232, 561-562 (1971).</li><li>Sinden, R. 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G. e. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=encoding+erythrocyte+binding+ligand+linked+to+blood+stage+multiplication+rate+phenotype+in+Plasmodium+yoelii+yoelii.">encoding erythrocyte binding ligand linked to blood stage multiplication rate phenotype in Plasmodium yoelii yoelii.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 7161-7166 (2009).</li><li>Pattaradilokrat, S., Cheesman, S. J., Carter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage+group+selection:+towards+identifying+genes+controlling+strain+specific+protective+immunity+in+malaria.">Linkage group selection: towards identifying genes controlling strain specific protective immunity in malaria.</a> PLoS One. 2, e857-e857 (2007).</li><li>Mackinnon, M. J., Read, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Relationships+between+Parasite+Virulence+and+Transmission+in+the+Rodent+Malaria+Plasmodium+chabaudi.">Genetic Relationships between Parasite Virulence and Transmission in the Rodent Malaria Plasmodium chabaudi.</a> Evolution. 53, 689-703 (1999).</li></ol>

Demonstramos as técnicas para a produção de um cruzamento genético no roedor da malária Plasmodium yoelii, que também é aplicável à produção de cruzamentos genéticos em malárias outros roedores. Infecções de camundongos com único clones parentais são normalmente realizados para determinar a transmissão bem sucedida dos parasitas dos pais para garantir que os pais são competentes em produzir gametas funcionais antes de realizar uma cruz. Transmissão bem-sucedida a...

MATERIAL SUPLEMENTAR: <ul><li> Manutenção de ratos de laboratório </li><li> Manutenção do laboratório de mosquitos </li><li> Exame microscópico de esfregaços de sangue corados com fina Giemsa </li><li> Medição da densidade dos glóbulos vermelhos </li></ul> Manutenção de ratos de laboratório Fêmeas de linhagem puras de laboratório camundongo BALB / c, com idades entre 5 a 8 semanas de idade, são usados ​​no estudo. Os ratos são alojados em um padrão sólido de policarbonato gaiola inferior com fio de bar-tampa, equipada com alimentador e uma garrafa de água. Os ratos são mantidos a uma temperatura constante (25 ± 1 ° C) em 12:12 horas luz: ciclo escuro. Ratos são permitidos para se alimentar de 2018S Teklad global Harlan 19% de proteína da dieta de roedores extrudados (esterilizável; de Harlan-Teklad) e é fornecido com acidificados ad libitum de água potável. Experiências com animais são realizadas em conformidade com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Comissão Animal Care e Uso do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas sob o protocolo LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland). Manutenção do laboratório de mosquitos Os mosquitos são de uma colônia de laboratório de raça de Anopheles stephensi. Os adultos são mantidos em gaiolas de nylon mantido em uma temperatura e sala com controle de umidade (23 a 25 ° C por Plasmodium chabaudi yoelii e Plasmodium, e 19 a 21 ° C para o Plasmodium berghei, 80-95% de umidade; em 12:12 horas de luz: ciclo escuro). Mosquitos adultos são alimentadas com glicose a 10% e 2,00% ácido para-aminobenzóico (PABA) solução de água suplementada. Para obter alta qualidade adultos, 500 larvas são cultivadas em uma condição de baixa densidade em 1 L de água destilada em uma de 1.000 cm 3 prato aberto fornecido com aproximadamente 1 mg de bicarbonato de sódio. Após a eclosão, as larvas são dadas TetraMin pó (PETCO) até que eles desenvolvem para a fase pupa e são transferidos para as gaiolas mosquito adulto para emergentes. Exame microscópico de esfregaços de sangue corados com fina Giemsa Usando a tesoura limpa cortando a ponta (1,0 mm) da cauda do rato infectado. Coloque uma gota (0,5-1,0 mL) de sangue da cauda para uma lâmina de espécime limpo. Mouse irá parar o sangramento em 1-2 min. Coloque um slide spreader limpa no topo da gota de sangue, mantendo-a em um ângulo de 45 ° em relação à lâmina da amostra, e permitir que o sangue a absorver a toda a largura do difusor. Segure a lâmina da amostra e avançar o slide spreader rapidamente e sem problemas para produzir um esfregaço fino. Deixe o filme de sangue seco, e, em seguida, mergulhe os slides em metanol absoluto. Permitir que o slide para o ar seco mais uma vez antes cobrindo-o com Giemsa (10% Giemsa corante em água destilada). Depois de incubar os filmes finos de sangue por 10-15 min em temperatura ambiente, cuidadosamente lavar as lâminas com água da torneira e deixe secar. Examine o número de glóbulos vermelhos infectados (iRBC; veja a Figura 3 para a morfologia da RBC infectados) sob um microscópio de luz com óleo de imersão em aumento de 1000x (com lente de 100x objetiva) e parasitemia calcular (o número de iRBC por 100 RBC contados). Diferentes cepas de parasitas da malária variam em taxa de crescimento e patogenicidade. Monitoramento de parasitemias estágio de sangue pode ser realizada 24 horas após as injeções, dependendo da dose do sangue parasitas da malária palco. Por exemplo, os ratos serão microscopicamente positiva 24 hrs, quando injetados com 10 7 infectados intraperitonealmente RBC ou RBC 10 6 infectados por via intravenosa. Medição da densidade dos glóbulos vermelhos Como os níveis de parasitemias, glóbulos vermelhos densidade (RBC) em camundongos infectados varia ao longo do curso da infecção. Densidade RBC deve ser medido dentro de 1-2 horas antes do início da infecção simples e mista-clone e os experimentos de clonagem. Existem dois métodos para a medição da densidade do RBC: a contagem manual usando hemocitômetro de Neubauer e uma contagem automática usando um Cellometer (Nexcelom Bioscience). Em ambos os métodos, retirar 1 mL de sangue da cauda do rato através de um capilar de vidro (VWR) e diluir em 10 mL de PBS e misture bem. Para usar um hemocitômetro de Neubauer, carga de 20 mL da suspensão para o hemocitômetro. Coloque o hemocitômetro em um microscópio de luz com lente objetiva de 10x. O hemacitómetro contém uma grade dividida em 9 quadrados grandes, e 4 quadrados grandes no canto são divididos em 16 pequenos quadrados. Contar o número total de células em cada um dos 16 pequenos quadrados nas quatro esquinas. Para evitar a contagem preconceito ou contagem de células que se sobrepõem uma linha de grade, a contagem de uma célula como &quot;in&quot; se sobrepõe as linhas superiores ou para a direita e &quot;out&quot; se sobrepõe as linhas de baixo ou da esquerda. Estimar o número de células por uma pequena praça e dividir por 0,00625 (o volume de um pequeno quadrado é de 6,25 nL). Isso gera o número de células por microlitro (&amp;mu; L). A partir destes dados, calcular a densidade das células vermelhas do sangue finais multiplicando com 10.000 (fator de diluição). Lavar a lamínula e câmara de contagem com água destilada e etanol 70%; ar seco. Alternativamente, carga de 20 mL da suspensão sobre uma lâmina de câmara Cellometer contagem. Inserir o slide em uma câmara de corrediça Cellometer (o leitor). Inicie o software Cellometer, selecione a opção &quot;glóbulos vermelhos&quot; opção, e digite um fator de diluição de 10.000. Registre a densidade RBC.

protocol for production of a genetic cross of the rodent malaria parasites

Variação na resposta a drogas antimaláricas e na patogenicidade do parasita da malária é de importância biológica e médica. Mapas de ligação tem levado à identificação de genes de sucesso ou loci subjacentes vários traços em parasitas da malária em roedores e seres humanos 1-3 4-6. O parasita da malária Plasmodium yoelii é uma das espécies de malária muitos isolados de roedores silvestres Africano e foi adaptado para crescer em laboratórios. Esta espécie se reproduz muitas das características biológicas dos parasitas da malária humana; marcadores genéticos, tais como microssatélites e amplificado comprimento de fragmentos polimorfismo (AFLP) marcadores também têm sido desenvolvidos para o parasita 7-9. Assim, estudos genéticos em parasitas da malária em roedores podem ser realizadas para complementar a pesquisa sobre o Plasmodium falciparum. Aqui, nós demonstrar as técnicas para a produção de um cruzamento genético em P. yoelii que foram pela primeira vez foi pioneira pelos drs. David Walliker, Richard Carter, e colegas da Universidade de Edimburgo 10. Cruzamentos genéticos em P. yoelii e outros parasitas da malária em roedores são conduzidas por infectando camundongos Mus musculus com um inóculo contendo gametócitos de dois clones geneticamente distintos que diferem em fenótipos de interesse e permitindo que mosquitos se alimentam de camundongos infectados quatro dias após a infecção. A presença de gametócitos masculinos e femininos no sangue do rato é microscopicamente confirmada antes da alimentação. Dentro de 48 horas após a alimentação, no intestino médio do mosquito, os gametócitos haplóides diferenciam em gametas masculinos e femininos, fertilize, e formar um zigoto diplóide (Fig. 1). Durante o desenvolvimento de um zigoto em um ookinete, meiose parece ocorrer 11. Se o zigoto é obtido através de fertilização cruzada entre os gametas dos dois parasitas geneticamente distintos, o intercâmbio genético (recombinação cromossômica e cross-overs entre as cromátides não irmãs de um par de cromossomos homólogos;. Fig. 2) pode ocorrer, resultando em recombinação de material genético de loci homólogos. Cada zigoto sofre sucessivas divisões dois nuclear, levando a quatro núcleos haplóides. Um ookinete desenvolve em um oocisto. Uma vez que os oocistos amadurece, milhares de esporozoítos (a descendência da cruz) são formados e libertados em hemoceal mosquito. Esporozoítos são colhidas das glândulas salivares e injetado em um novo hospedeiro murino, onde o desenvolvimento fase pré-eritrocítica e eritrocitárias ocorre. Formas eritrocitárias são clonados e classificados em relação aos personagens distinguir os genitores antes de mapas de ligação genética. Controle de infecções individuais clones parentais são realizadas da mesma forma como a produção de um cruzamento genético.

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Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Cruzamentos genéticos de parasitas da malária em roedores são realizadas, alimentando dois parasitas geneticamente distintas para os mosquitos. Progênie recombinante são clonados a partir de sangue do rato depois de permitir que mosquitos a morder camundongos infectados. Este vídeo mostra como produzir cruzamentos genéticos de<em&gt; Plasmodium yoelii</em&gt; E é aplicável a outros parasitas da malária em roedores.

Protocolo para produção de uma Cruz genética do parasita da malária de roedores

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Imunologia e Infecção

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