Name: protocol for production of a genetic cross of the rodent malaria parasites
Uploaded: 2011-01-03T17:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites at JoVE.com

Мы благодарим доктора Рэнди Элкинс, Робин Kastenmayer, Тед Торри, Дэн Паре и Tovi Lehman за критическое прочтение рукописи. Эта работа была поддержана Внутренние программы исследований Отдела Внутренние исследований, Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний, Национальные институты здравоохранения, а также 973 Национальные программы фундаментальных исследований Китая, # 2007CB513103. Мы благодарим NIAID очной редактор Бренда Маршалл Рей об оказании помощи.

Асептический методы должны применяться ко всем материалам, которые будут администрируемых в животных, чтобы избежать случайного введения экзогенных инфекционных агентов в организм мышей, которые можно смешивать экспериментальных результатов. 1. Заражение лабораторны?...

<ol>
	<li>Hayton, K., Ranford-Cartwright, L. C., Walliker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulfadoxine-pyrimethamine+resistance+in+the+rodent+malaria+parasite+Plasmodium+chabaudi.">Sulfadoxine-pyrimethamine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 2482-2489 (2002).</li><li>Cravo, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+mefloquine+resistance+in+the+rodent+malaria+parasite+Plasmodium+chabaudi.">Genetics of mefloquine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi.</a> Antimicrob Agents Chemother. 47, 709-718 (2003).</li><li>Hunt, P., Cravo, P. V., Donleavy, P., Carlton, J. M., Walliker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroquine+resistance+in+Plasmodium+chabaudi:+are+chloroquine-resistance+transporter+(crt)+and+multi-drug+resistance+(mdr1)+orthologues+involved?.">Chloroquine resistance in Plasmodium chabaudi: are chloroquine-resistance transporter (crt) and multi-drug resistance (mdr1) orthologues involved?.</a> Mol Biochem Parasitol. 133, 27-35 (2004).</li><li>Yuan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mapping+of+targets+mediating+differential+chemical+phenotypes+in+Plasmodium+falciparum.">Genetic mapping of targets mediating differential chemical phenotypes in Plasmodium falciparum.</a> Nat Chem Biol. 5, 765-771 (2009).</li><li>Su, X., Kirkman, L. A., Fujioka, H., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+polymorphisms+in+an+approximately+330+kDa+protein+are+linked+to+chloroquine-resistant+P.+falciparum+in+Southeast+Asia+and+Africa.">Complex polymorphisms in an approximately 330 kDa protein are linked to chloroquine-resistant P. falciparum in Southeast Asia and Africa.</a> Cell. 91, 593-603 (1997).</li><li>Hayton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythrocyte+binding+protein+PfRH5+polymorphisms+determine+species-specific+pathways+of+Plasmodium+falciparum+invasion.">Erythrocyte binding protein PfRH5 polymorphisms determine species-specific pathways of Plasmodium falciparum invasion.</a> Cell Host Microbe. 4, 40-51 (2008).</li><li>Pattaradilokrat, S., Cheesman, S. J., Carter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenicity+and+genetic+polymorphism+in+cloned+lines+derived+from+a+single+isolate+of+a+rodent+malaria+parasite.">Congenicity and genetic polymorphism in cloned lines derived from a single isolate of a rodent malaria parasite.</a> Mol Biochem Parasitol. 157, 244-247 (2008).</li><li>Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hundreds+of+microsatellites+for+genotyping+Plasmodium+yoelii+parasites.">Hundreds of microsatellites for genotyping Plasmodium yoelii parasites.</a> Mol Biochem Parasitol. 166, 153-158 (2009).</li><li>Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Typing+Plasmodium+yoelii+microsatellites+using+a+simple+and+affordable+fluorescent+labeling+method.">Typing Plasmodium yoelii microsatellites using a simple and affordable fluorescent labeling method.</a> Mol Biochem Parasitol. 155, 94-102 (2007).</li><li>Walliker, D., Carter, R., Morgan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+recombination+in+malaria+parasites.">Genetic recombination in malaria parasites.</a> Nature. 232, 561-562 (1971).</li><li>Sinden, R. E., Hartley, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+meiotic+division+of+malarial+parasites.">Identification of the meiotic division of malarial parasites.</a> J Protozool. 32, 742-744 (1985).</li><li>Ozaki, L. S., Gwadz, R. W., Godson, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+centrifugation+method+for+rapid+separation+of+sporozoites+from+mosquitoes.">Simple centrifugation method for rapid separation of sporozoites from mosquitoes.</a> J Parasitol. 70, 831-833 (1984).</li><li>Yoeli, M., Most, H., Bone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+berghei:+cyclical+transmission+by+experimentally+infected+Anopheles+quadrimachulatus.">Plasmodium berghei: cyclical transmission by experimentally infected Anopheles quadrimachulatus.</a> Science. 144, 1580-1581 (1964).</li><li>Landau, I., Boulard, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Life cycles and Morphology. , (1978).</li><li>Vanderbergh, J. P. Y., M, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+on+sporogonic+development+of+Plasmodium+berghei.">Effects of temperature on sporogonic development of Plasmodium berghei.</a> J Parasitol. 52, 559-564 (1966).</li><li>Gadsby, N., Lawrence, R., Carter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+on+pathogenicity+and+mosquito+transmission+success+in+the+rodent+malaria+parasite+Plasmodium+chabaudi+adami.">A study on pathogenicity and mosquito transmission success in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi adami.</a> Int J Parasitol. 39, 347-354 (2009).</li><li>Pattaradilokrat, S., Culleton, R. L., Cheesman, S. J., Carter, R. G. e. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=encoding+erythrocyte+binding+ligand+linked+to+blood+stage+multiplication+rate+phenotype+in+Plasmodium+yoelii+yoelii.">encoding erythrocyte binding ligand linked to blood stage multiplication rate phenotype in Plasmodium yoelii yoelii.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 7161-7166 (2009).</li><li>Pattaradilokrat, S., Cheesman, S. J., Carter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage+group+selection:+towards+identifying+genes+controlling+strain+specific+protective+immunity+in+malaria.">Linkage group selection: towards identifying genes controlling strain specific protective immunity in malaria.</a> PLoS One. 2, e857-e857 (2007).</li><li>Mackinnon, M. J., Read, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Relationships+between+Parasite+Virulence+and+Transmission+in+the+Rodent+Malaria+Plasmodium+chabaudi.">Genetic Relationships between Parasite Virulence and Transmission in the Rodent Malaria Plasmodium chabaudi.</a> Evolution. 53, 689-703 (1999).</li></ol>

Мы демонстрируем методы для производства генетических крест грызунов малярии Plasmodium yoelii, которое также применимо к производству генетического кресты и в других малярии грызунов. Инфекции мышей с одной родительской клоны, как правило, проводится для определения успешной передачи ...

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ: <ul><li> Техническое обслуживание лабораторных мышей </li><li> Техническое обслуживание лабораторных комаров </li><li> Микроскопическое исследование тонких мазков крови окрашивали Гимза </li><li> Измерение плотности красных клеток крови </li></ul> Техническое обслуживание лабораторных мышей Самки мышей инбредных штамм лаборатории BALB / с, в возрасте от 5 до 8 недель, которые используются в исследовании. Мыши размещены в стандартном твердого поликарбоната нижней клетке с проволокой-бар крышкой, оснащенной фидера и бутылку воды. Мыши поддерживается при постоянной температуре (25 ± 1 ° С) на 12:12 час свет: темно-цикла. Мыши могут питаться 2018S Харлан Teklad Глобальный 19% белка экструдированного диеты грызунов (стерилизация, от Харлан-Teklad) и поставляется с подкисленной питьевую воду без ограничений. Эксперименты на животных проводятся в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными уходу и использованию животных комитетом на Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний по протоколу LMVR11E (Национальный институт здоровья, Бетезда, штат Мэриленд). Техническое обслуживание лабораторных комаров Комары из лаборатории воспитанный колонии Anopheles stephensi. Взрослые ведутся в нейлоновых клетки хранятся в температуре и влажности контролируемой комнате (от 23 до 25 ° С для плазмодия Plasmodium yoelii и chabaudi, и 19 до 21 ° С в течение Plasmodium berghei; от 80 до 95% влажности, с 12:12 часов свет: темно-цикла). Взрослые комары питаются 10% глюкозы и 2,00% парааминобензойной кислотой (ПАБК) дополнить водного раствора. Для получения высококачественных взрослых, 500 личинок, выращенных в низкой плотности состояние в 1 л дистиллированной воды в 1000 см 3 открытых блюда поставляются с примерно 1 мг натрия бикарбоната. После вылупления личинок приведены TetraMin порошка (PETCO), пока они не перерастают в стадии куколки и передаются в клетках взрослого комара для развивающихся. Микроскопическое исследование тонких мазков крови окрашивали Гимза Использование чистых ножницами отрезать кончик (1,0 мм), хвоста инфицированные мыши. Поместите одну каплю (0,5-1,0 мкл) хвоста кровь на чистую слайд образца. Мышь будет остановить кровотечение в течение 1-2 мин. Место чистое слайд разбрасыватель на вершине капли крови, поддержание его на угол 45 ° по отношению к образцу слайдов, и позволяют крови адсорбироваться на всю ширину шпателя. Держите образец слайдов и продвигать разбрасыватель слайд быстро и плавно производить тонкий мазок. Пусть кровь фильм сухой, а затем погружают слайды в абсолютном метаноле. Разрешить слайд высохнуть на воздухе еще раз перед покрывая ее Гимза (10% Гимза красителя в дистиллированной воде). После инкубации тонких пленок крови в течение 10-15 минут при комнатной температуре, тщательно промойте слайды с водопроводной водой и дайте ему высохнуть на воздухе. Проверьте количество зараженных эритроцитов (iRBC, см. рисунок 3 для морфологии зараженных РБК) под световым микроскопом с погружением нефть на увеличение 1000x (с объективом 100х) и вычислим паразитемии (количество iRBC на 100 РБК в счет). Различные штаммы малярийных паразитов различаются по скорости роста и патогенности. Мониторинг parasitaemias крови этап может быть выполнен за 24 часа после инъекции, в зависимости от дозы крови паразиты стадии малярии. Например, мыши будет положительным микроскопически 24 часов при введении с 10 7 инфицированных РБК внутрибрюшинно или 10 6 инфицированных РБК внутривенно. Измерение плотности красных клеток крови Как уровни parasitaemias, красных кровяных клеток (эритроцитов) плотности в зараженных мышей изменяется в течение всего инфекция. РБК плотности следует измерять в течение 1-2 часов до начала одно-и смешанных инфекций и клон клонирование экспериментов. Есть два метода для измерения плотности РБК: ручного подсчета использованием Нойбауэр гемоцитометра и автоматического подсчета использованием Cellometer (Nexcelom Bioscience). В обоих методах, снять 1 мкл мыши хвост крови с помощью стеклянного капилляра (VWR) и разбавить в 10 мл PBS и хорошо перемешать. Для использования гемоцитометра Нойбауэр, нагрузка 20 мкл суспензии на hemacytometer. Место hemacytometer на световой микроскоп с 10-кратным объективом. Hemacytometer содержит сетки разделена на 9 больших площадях, и 4 больших площадей на углу свою очередь делятся на 16 маленьких квадратов. Подсчитать общее число ячеек в каждой из 16 малых квадратов в четыре квадрата угла. Чтобы избежать предвзятости или подсчет подсчетом клетки, которые накладываются линии сетки, граф клетки как &quot;в&quot;, перекрывает ли он сверху или правой линии и &quot;вне&quot;, перекрывает ли он вниз или слева линий. Оцените число клеток на один маленький квадрат и разделить на 0,00625 (объем одной небольшой площади 6,25 NL). Это дает число клеток на микролитр (&amp;му, L). Исходя из этих данных, вычислить окончательный красный плотность кровяных клеток путем умножения на 10 тысяч (коэффициент разбавления). Промыть скольжения крышкой и счетной камеры с дистиллированной водой и 70% этилового спирта; высохнуть на воздухе. Кроме того, нагрузка 20 мкл суспензии на камеру слайд подсчета Cellometer. Вставьте слайд в Cellometer камере слайд (читателя). Начало Cellometer программного обеспечения, выберите &quot;красных клеток крови&quot; вариант, и введите коэффициент разбавления 10000. Запись плотности РБК.

protocol for production of a genetic cross of the rodent malaria parasites

Изменения в ответ на противомалярийных препаратов и патогенность малярийных паразитов имеет биологическую и медицинскую значимость. Связь отображение привело к успешной идентификации генов или локусов лежащий в основе различные черты в малярийных паразитов грызунов и человека 1-3 4-6. Малярийного паразита Plasmodium yoelii является одним из многих видов малярии, изолированных от диких африканских грызунов и была адаптирована для роста в лабораториях. Этот вид воспроизводит многие биологические характеристики человека малярийных паразитов; генетических маркеров, таких как микроспутник и усиливаются полиморфизма длины фрагмента (AFLP) маркеры были также разработаны для паразита 7-9. Таким образом, генетические исследования возбудителя малярии грызунов могут быть выполнены в дополнение к исследованиям на Plasmodium тропической. Здесь мы демонстрируем методы получения генетического крест в P. yoelii, что впервые были пионерами докторами. Дэвид Walliker, Ричард Картер, и его коллеги из Эдинбургского университета 10. Генетические крестов в P. yoelii и других паразитов малярии грызунов проводятся путем заражения мышей Mus мышцы с посевной содержащие гаметоциты двух генетически различных клонов, отличающихся фенотипов интереса и позволяя комаров кормить на зараженных мышей через 4 дня после инфицирования. Наличие мужского и женского гаметоциты в кровь мыши микроскопически подтверждено перед кормлением. В течение 48 часов после кормления, в средней кишке комаров, гаплоидный гаметоциты дифференцироваться в мужской и женской гамет, удобрять и образуют диплоидные зиготы (рис. 1). Во время развития зиготы в ookinete, мейоз появляется происходить 11. Если зиготы происходит через перекрестное опыление между гаметы из двух генетически различных паразитов, генетический обмен (хромосомная рекомбинации и кроссоверов между не-сестринских хроматид из пары гомологичных хромосом;. Рис. 2) может иметь место, в результате рекомбинации генетического материала на гомологичных локусов. Каждая зигота претерпевает два последовательных делений ядра, что приводит к четыре гаплоидных ядер. Ookinete дальнейшем перерастает в ооцисты. После ооцисты созревает, тысячи спорозоитов (потомство крест) формируются и выпущены в hemoceal комара. Спорозоиты собирают из слюнных желез и вводят новые мышиные хозяин, где пре-эритроцитарных и эритроцитарных этапе развития имеет место. Эритроцитарных форм клонируются и классифицируются исходя из отличительных символов родительских линий до генетического картирования связи. Управление инфекций индивидуальных родительских клонов выполняются таким же образом, как производство генетической крест.

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites at JoVE.com

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Генетические кресты паразитов малярии грызунов проводится путем подачи двух генетически различных паразитов комаров. Рекомбинантный потомства клонированных из крови мышей после учета комары кусать зараженных мышей. Это видео показывает, как производить генетические кресты<em&gt; Plasmodium yoelii</em&gt; И применим и к другим малярийных паразитов грызунов.

Протокол по производству Генетические Креста Паразиты грызунов малярией

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

В естественных изображений трансгенных Паразиты Leishmania в реальный хост

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Протокол для сбора и окрашивания гемоциты от желтой лихорадки комаров Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Простой протокол Chelex для выделения ДНК из<em&gt; Anopheles</em&gt; SPP.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetic Manipulation in ÃƒÅ½Ã¢â‚¬Âku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Генетические манипуляции<em&gt; Δku80</em&gt; Штаммов для функционального геномного анализа<em&gt; Токсоплазма</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Ретровирусное трансдукция Т-хелперы как генетический подход к изучению механизмов, контролирующих их дифференцировку и функции

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

Простой эритроцит Лизис Метод создании B лимфобластоидная клеточных линий

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

Фенотипический анализ грызунов малярии паразита асексуальных и сексуальной крови этапов и комаров этапов

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Роман фидер бесплатная система для массового производства мышиных естественных клеток-киллеров в пробирке

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Количественная оценка внутриклеточных роста внутри макрофагов является быстрый и надежный метод оценки вирулентности лейшмании паразитов

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃƒÅ½Ã‚Â³R Cross-linking

Измерение расхода гранулярных производства рос в макрофагах в ответ на FcγR сшивки

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...