Name: protocol for production of a genetic cross of the rodent malaria parasites
Uploaded: 2011-01-03T17:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites at JoVE.com

Vi tackar Dr Randy Elkins, Robin Kastenmayer, Ted Torrey, Dan Pare och Tovi Lehman för kritisk läsning av manuskript. Detta arbete stöddes av Interna forskningsprogram Avdelningen för Interna Forskning, National Institute of Allergy och infektionssjukdomar, National Institutes of Health, och av 973 nationella Grundläggande forskningsprogram av Kina # 2007CB513103. Vi tackar NIAID intramural redaktör Brenda Rae Marshall för hjälp.

Aseptiska tekniker måste tillämpas på allt material som kommer att administreras till djur för att undvika oavsiktlig introduktion av exogena smittämnen på möss som kan förbrylla experimentella resultat. 1. Infektion av laboratoriemöss med Blood steg malariaparasiter <ol><li> Vid rumstemperatur, tina två flaskor med de frysta blodparasiter skede malaria ska passeras. I detta exempel två gnagare malariaparasiten används stammar är Plasmodium yoelii yoelii och Plasm...

<ol>
	<li>Hayton, K., Ranford-Cartwright, L. C., Walliker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulfadoxine-pyrimethamine+resistance+in+the+rodent+malaria+parasite+Plasmodium+chabaudi.">Sulfadoxine-pyrimethamine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 2482-2489 (2002).</li><li>Cravo, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+mefloquine+resistance+in+the+rodent+malaria+parasite+Plasmodium+chabaudi.">Genetics of mefloquine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi.</a> Antimicrob Agents Chemother. 47, 709-718 (2003).</li><li>Hunt, P., Cravo, P. V., Donleavy, P., Carlton, J. M., Walliker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroquine+resistance+in+Plasmodium+chabaudi:+are+chloroquine-resistance+transporter+(crt)+and+multi-drug+resistance+(mdr1)+orthologues+involved?.">Chloroquine resistance in Plasmodium chabaudi: are chloroquine-resistance transporter (crt) and multi-drug resistance (mdr1) orthologues involved?.</a> Mol Biochem Parasitol. 133, 27-35 (2004).</li><li>Yuan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mapping+of+targets+mediating+differential+chemical+phenotypes+in+Plasmodium+falciparum.">Genetic mapping of targets mediating differential chemical phenotypes in Plasmodium falciparum.</a> Nat Chem Biol. 5, 765-771 (2009).</li><li>Su, X., Kirkman, L. A., Fujioka, H., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+polymorphisms+in+an+approximately+330+kDa+protein+are+linked+to+chloroquine-resistant+P.+falciparum+in+Southeast+Asia+and+Africa.">Complex polymorphisms in an approximately 330 kDa protein are linked to chloroquine-resistant P. falciparum in Southeast Asia and Africa.</a> Cell. 91, 593-603 (1997).</li><li>Hayton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythrocyte+binding+protein+PfRH5+polymorphisms+determine+species-specific+pathways+of+Plasmodium+falciparum+invasion.">Erythrocyte binding protein PfRH5 polymorphisms determine species-specific pathways of Plasmodium falciparum invasion.</a> Cell Host Microbe. 4, 40-51 (2008).</li><li>Pattaradilokrat, S., Cheesman, S. J., Carter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenicity+and+genetic+polymorphism+in+cloned+lines+derived+from+a+single+isolate+of+a+rodent+malaria+parasite.">Congenicity and genetic polymorphism in cloned lines derived from a single isolate of a rodent malaria parasite.</a> Mol Biochem Parasitol. 157, 244-247 (2008).</li><li>Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hundreds+of+microsatellites+for+genotyping+Plasmodium+yoelii+parasites.">Hundreds of microsatellites for genotyping Plasmodium yoelii parasites.</a> Mol Biochem Parasitol. 166, 153-158 (2009).</li><li>Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Typing+Plasmodium+yoelii+microsatellites+using+a+simple+and+affordable+fluorescent+labeling+method.">Typing Plasmodium yoelii microsatellites using a simple and affordable fluorescent labeling method.</a> Mol Biochem Parasitol. 155, 94-102 (2007).</li><li>Walliker, D., Carter, R., Morgan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+recombination+in+malaria+parasites.">Genetic recombination in malaria parasites.</a> Nature. 232, 561-562 (1971).</li><li>Sinden, R. E., Hartley, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+meiotic+division+of+malarial+parasites.">Identification of the meiotic division of malarial parasites.</a> J Protozool. 32, 742-744 (1985).</li><li>Ozaki, L. S., Gwadz, R. W., Godson, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+centrifugation+method+for+rapid+separation+of+sporozoites+from+mosquitoes.">Simple centrifugation method for rapid separation of sporozoites from mosquitoes.</a> J Parasitol. 70, 831-833 (1984).</li><li>Yoeli, M., Most, H., Bone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+berghei:+cyclical+transmission+by+experimentally+infected+Anopheles+quadrimachulatus.">Plasmodium berghei: cyclical transmission by experimentally infected Anopheles quadrimachulatus.</a> Science. 144, 1580-1581 (1964).</li><li>Landau, I., Boulard, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Life cycles and Morphology. , (1978).</li><li>Vanderbergh, J. P. Y., M, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+on+sporogonic+development+of+Plasmodium+berghei.">Effects of temperature on sporogonic development of Plasmodium berghei.</a> J Parasitol. 52, 559-564 (1966).</li><li>Gadsby, N., Lawrence, R., Carter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+on+pathogenicity+and+mosquito+transmission+success+in+the+rodent+malaria+parasite+Plasmodium+chabaudi+adami.">A study on pathogenicity and mosquito transmission success in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi adami.</a> Int J Parasitol. 39, 347-354 (2009).</li><li>Pattaradilokrat, S., Culleton, R. L., Cheesman, S. J., Carter, R. G. e. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=encoding+erythrocyte+binding+ligand+linked+to+blood+stage+multiplication+rate+phenotype+in+Plasmodium+yoelii+yoelii.">encoding erythrocyte binding ligand linked to blood stage multiplication rate phenotype in Plasmodium yoelii yoelii.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 7161-7166 (2009).</li><li>Pattaradilokrat, S., Cheesman, S. J., Carter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage+group+selection:+towards+identifying+genes+controlling+strain+specific+protective+immunity+in+malaria.">Linkage group selection: towards identifying genes controlling strain specific protective immunity in malaria.</a> PLoS One. 2, e857-e857 (2007).</li><li>Mackinnon, M. J., Read, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Relationships+between+Parasite+Virulence+and+Transmission+in+the+Rodent+Malaria+Plasmodium+chabaudi.">Genetic Relationships between Parasite Virulence and Transmission in the Rodent Malaria Plasmodium chabaudi.</a> Evolution. 53, 689-703 (1999).</li></ol>

Vi visar tekniker för produktion av en genetisk kryss i gnagare malaria Plasmodium yoelii, som även gäller för produktionen av genetisk kors i andra gnagare malarias. Infektioner i möss med samma föräldrapenning kloner är vanligen utförs för att bestämma en framgångsrik överföring av föräldrarnas parasiter att se till att föräldrarna är kompetenta att producera funktionella könsceller innan du utför ett kors. Framgångsrik överföring via en mygga påverkas av ...

Kompletterande material: <ul><li> Underhåll av laboratoriemöss </li><li> Underhåll av laboratorie-myggor </li><li> Mikroskopisk undersökning av tunna blodutstryk färgas med Giemsa fläcken </li><li> Mätning av röda blodkroppar densitet </li></ul> Underhåll av laboratoriemöss Honor av inavlade laboratorie musstam BALB / c, i åldern 5 till 8 veckor gamla, används i studien. Möss är inrymt i en vanlig fast botten polykarbonat bur med wire-bar lock, utrustad med arkmatare och en vattenflaska. Möss hålls vid en konstant temperatur (25 ± 1 ° C) på 12:12 timmars ljus: mörk cykel. Möss får livnära sig på 2018S Harlan Teklad Global 19% protein extruderad gnagare kost (steriliserbara, från Harlan-Teklad) och levereras med syrad dricksvatten ad lib. Djurförsök utförs i enlighet med de riktlinjer och regler som anges i Animal skötsel och användning kommittén vid det nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar enligt protokoll LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland). Underhåll av laboratorie-myggor Myggor är från ett laboratorium-uppfödda kolonin Anopheles stephensi. De vuxna hålls i nylon burarna förvaras i en temperatur-och luftfuktighet kontrollerad rum (23 till 25 ° C för Plasmodium yoelii och Plasmodium chabaudi, och 19 till 21 ° C för Plasmodium berghei, 80 till 95% luftfuktighet, på 12:12 timmar ljus: mörker-cykel). Vuxna myggor utfodras med 10% glukos och 2,00% paraaminobensoesyra (PABA) kompletteras vattenlösning. För att få hög kvalitet vuxna är 500 larver odlas i en låg densitet tillstånd i 1 l destillerat vatten i en 1000 cm 3 öppna fat levereras med ca 1 mg natrium bikarbonat. Efter kläckningen är de larver ges tetramin pulver (PETCO) tills de utvecklas till puppa stadiet och överförs till den vuxna myggan burar för fram. Mikroskopisk undersökning av tunna blodutstryk färgas med Giemsa fläcken Använda ren sax klippa bort spetsen (1,0 mm) av de smittade musens svans. Placera en droppe (0,5 till 1,0 mikroliter) av svansen blod på ett rent exemplar bild. Musen kommer att stoppa blödning i 1-2 min. Placera en ren spridare bild på toppen av bloddroppen, upprätthålla det i 45 ° vinkel i förhållande till den förlaga bilden och låta blodet att bindas till hela bredden av spridaren. Håll provet bilden och driva spridaren bilden snabbt och smidigt att ta fram en tunn smet. Låt blodet filmen torka och sedan doppa objektglasen i absolut metanol. Låt bilden lufttorka gång innan du täcker den med Giemsa fläcken (10% Giemsa färgämnet i destillerat vatten). Efter inkubering av tunna blodet filmer för 10-15 min i rumstemperatur, noggrant skölj glasen med kranvatten och låt det lufttorka. Undersök antalet infekterade röda blodkroppar (iRBC, se figur 3 för morfologi av infekterade RBC) i ett ljusmikroskop med immersionsolja vid 1000x förstoring (med 100x objektiv) och beräkna parasitemia (antalet iRBC per 100 RBC räknas). Olika stammar av malariaparasiter varierar i tillväxt och patogenicitet. Övervakning av parasitaemias blod skede kan göras 24 timmar efter injektion, beroende på dosen av malaria blodet scenen parasiter. Till exempel kommer mössen att mikroskopiskt positiva 24 timmar när det injiceras med 10 7 infekterade RBC intraperitonealt eller 10 6 infekterade RBC intravenöst. Mätning av röda blodkroppar densitet Liksom nivåer parasitaemias, röda blodkroppar (RBC) täthet i infekterade möss varierar under hela infektion. RBC täthet ska mätas inom 1-2 timmar före starten av en-och mixed-klon infektion och experimenten kloning. Det finns två metoder för mätning av RBC densitet: en manuell räkning med Neubauer hemocytometer och en automatisk räkning med hjälp av en Cellometer (Nexcelom Bioscience). I båda metoderna ut 1 mikroliter av mus svans blod med hjälp av ett glas kapillär (VWR) och späd i 10 ml PBS och blanda väl. För att använda ett Neubauer hemocytometer, belastning 20 mikroliter av fjädring på hemacytometer. Placera hemacytometer på ett ljusmikroskop med 10x objektiv. Den hemacytometer innehåller ett rutnät indelat i 9 stora rutor och 4 stora rutor i hörnet är vidare indelade i 16 små rutor. Räkna det totala antalet celler i varje av de 16 små rutor i de fyra hörn torg. Att undvika att räkna partiskhet eller räkna celler som överlappar en rutnätslinje, räkna en cell som &quot;i&quot; om det överlappar den övre eller rätt riktning och &quot;ute&quot; om det överlappar den nedre eller vänster linjer. Uppskatta antalet celler per ett litet torg och dividera med 0,00625 (volymen av en liten kvadrat är 6,25 NL). Detta ger antalet celler per mikroliter (&amp;mu, L). Av dessa data beräknar de slutliga röda densitet blodkroppar genom att multiplicera med 10.000 (en utspädningsfaktor). Skölj täckglas och räknekammare med destillerat vatten och 70% etanol, lufttorka. Alternativt belastning 20 mikroliter av fjädring på en Cellometer räknekammare bild. Sätt in bilden i ett Cellometer bild kammare (läsaren). Starta Cellometer programmet, välj &quot;röda blodkroppar&quot; alternativet och ange en utspädningsfaktor på 10.000. Anteckna RBC densitet.

protocol for production of a genetic cross of the rodent malaria parasites

Variation i reaktion mot malariamedel och patogenicitet av malariaparasiter är av biologisk och medicinsk betydelse. Koppling kartläggning har lett till framgång i att identifiera gener eller loci bakom olika drag i malariaparasiter av gnagare 1-3 och människor 4-6. Malariaparasiten Plasmodium yoelii är en av många malaria arter isolerats från vilda afrikanska gnagare och har anpassats för att växa i laboratorier. Denna art återger många av de biologiska egenskaperna hos den mänskliga malariaparasiter, genetiska markörer som mikrosatellit och förstärkta fragmentet längd polymorfism (AFLP) markörer har också utvecklats för parasiten 7-9. Således kan genetiska studier i parasiter gnagare malaria utföras som ett komplement till forskning om Plasmodium falciparum. Här visar vi de tekniker för att producera en genetisk kors i P. yoelii som först uppfunnen av Dr. David Walliker, Richard Carter, och kollegor vid University of Edinburgh 10. Genetisk kors i P. yoelii och andra gnagare malariaparasiter sker genom att infektera möss Mus musculus med ett inokulat som innehåller gametocyter av två genetiskt distinkta kloner som skiljer sig fenotyper av intresse och genom att låta myggor att livnära sig på den infekterade möss 4 dagar efter infektion. Förekomsten av manliga och kvinnliga gametocyter i musen blodet är mikroskopiskt bekräftas innan utfodring. Inom 48 timmar efter utfodring i midgut av mygga, det haploida gametocyter differentiera till manliga och kvinnliga könsceller, befrukta, och bilda en diploid zygot (bild 1). Under utvecklingen av en zygot till en ookinete verkar meios ske 11. Om zygoten framställs genom korsbefruktning mellan könsceller från två genetiskt skilda parasiter, genetisk utbyte (kromosomala reassortment och cross-overs mellan de icke-systerkromatider av ett par av homologa kromosomer,. Fig. 2) kan förekomma, vilket resulterar i rekombination av genetiskt material på homolog loci. Varje zygot genomgår två på varandra kärnvapen divisioner, vilket leder till fyra haploida kärnor. En ookinete utvecklas ytterligare i en oocyst. När oocyst mognar, tusentals sporozoites (avkomman av korset) bildas och släpps ut i mygga hemoceal. Sporozoites skördas från spottkörtlar och sprutas in i en ny mus värd, där pre-erytrocyt och erytrocyt stadiet utveckling sker. Erytrocyt former är klonade och klassificeras med avseende på tecken särskilja föräldralinjer innan genetisk koppling kartläggning. Bekämpa infektion av enskilda föräldrarnas kloner utförs på samma sätt som produktionen av en genetisk kors.

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites at JoVE.com

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Genetiska korsningar av parasiter gnagare malaria utförs genom att mata två genetiskt skilda parasiter till myggor. Rekombinant avkomma är klonade från mus blodet efter så att myggorna att bita infekterade möss. Denna video visar hur man kan producera genetiska korsningar av<em&gt; Plasmodium yoelii</em&gt; Och gäller andra parasiter gnagare malaria.

Protokoll för produktion av en genetisk kors av parasiterna Gnagare Malaria

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo avbildning av Transgena Leishmania parasiter i ett Live-värd

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Ett protokoll för insamling och färgning hemocyter från gula febern Mosquito Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

En enkel Chelex protokoll för DNA-extraktion från<em&gt; Anopheles</em&gt; SPP.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetic Manipulation in ÃƒÅ½Ã¢â‚¬Âku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetisk manipulation i<em&gt; Δku80</em&gt; Stammar för funktionell genomik Analys av<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Retroviral Transduction av Helper T-celler som en genetisk strategi för att studera mekanismer som styr deras differentiering och funktion

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

En enkel röda blodkroppar Lysis metod för upprättande av B lymfoblastoidcellinjer

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

Fenotypisk analys av gnagare malaria parasit asexuella och sexuella blod stadier och Myggstadier

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

En roman Feeder-fria System för massproduktion av murina naturliga mördarceller In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Kvantifiering av intracellulära tillväxt inuti makrofager är en snabb och tillförlitlig metod för att bedöma virulens Leishmania parasiter

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃƒÅ½Ã‚Â³R Cross-linking

Flödescytometrisk flödesmätning av ROS produktion i makrofager som svar på FcγR Cross-linking

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...