Name: recombinant retroviral production and infection of b cells
Uploaded: 2011-02-18T16:00:00
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CK wird von der Columbia University Graduate-Programm unterstützt. UB ist Fellow der Leukemia and Lymphoma Society of America, die Empfänger von New Investigator Award der Leukämie Research Foundation und wird von der Columbia University New Faculty Anschubfinanzierung unterstützt.

1. Milz B-Lymphozyten-Isolierung und Stimulation <ol><li> Ernten Sie die Milz von AID-defizienten Mäusen 12 zwischen 2-3 Monate alt. Die Isolierung der Milz ist in sterilen Bedingungen durchgeführt und die Organe sind vorübergehend in kaltem Phosphatpuffer (PBS) mit 15% fötalem Rinderserum (FBS) gehalten. </li><li> Die Milz wird dann auf eine sterile Gewebekultur Haube übertragen und homogenisiert in 5 ml PBS mit 2,5% FBS. Übertragen Sie die Homogenat in ein 15 ml Falcon-Röhrchen. </li><li> Centrifug...

<ol>
	<li>Bartholdy, B., Matthias, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+B+cell+development+and+function.">Transcriptional control of B cell development and function.</a> Gene. 327, 1-23 (2004).</li><li>Henderson, A., Calame, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+during+B+cell+development.">Transcriptional regulation during B cell development.</a> Annu Rev Immunol. 16, 163-200 (1998).</li><li>Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+plasticity+of+hematopoietic+cells.">Differentiation plasticity of hematopoietic cells.</a> Blood. 99, 3089-30101 (2002).</li><li>Xiao, C., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+control+in+the+immune+system:+basic+principles.">MicroRNA control in the immune system: basic principles.</a> Cell. 136, 26-36 (2009).</li><li>Waterston, R. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+39-kDa+protein+on+activated+helper+T+cells+binds+CD40+and+transduces+the+signal+for+cognate+activation+of+B+cells.">A 39-kDa protein on activated helper T cells binds CD40 and transduces the signal for cognate activation of B cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6550-6554 (1992).</li><li>Muramatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class+switch+recombination+and+hypermutation+require+activation-induced+cytidine+deaminase+(AID),+a+potential+RNA+editing+enzyme.">Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme.</a> Cell. 102, 553-563 (2000).</li><li>Yelle, J., Dion, M., Hamelin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+viral+DNA+in+optimal+culture+conditions.">Efficient transfection of mammalian cells with viral DNA in optimal culture conditions.</a> J Virol Methods. 7, 321-326 (1983).</li><li>Chen, C., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transformation+of+mammalian+cells+by+plasmid+DNA.">High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA.</a> Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).</li><li>Fagarasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+class+switching+and+differentiation+to+IgA-producing+cells+in+the+gut+lamina+propria.">In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria.</a> Nature. 413, 639-6343 (2001).</li><li>Basu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AID+antibody+diversification+enzyme+is+regulated+by+protein+kinase+A+phosphorylation.">The AID antibody diversification enzyme is regulated by protein kinase A phosphorylation.</a> Nature. 438, 508-5011 (2005).</li><li>McBride, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+class+switch+recombination+and+somatic+mutation+by+AID+phosphorylation.">Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation.</a> J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).</li><li>Barreto, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AID+from+bony+fish+catalyzes+class+switch+recombination.">AID from bony fish catalyzes class switch recombination.</a> J Exp Med. 202, 733-738 (2005).</li><li>Delphin, S., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+antibody+class+switching+to+IgE:+characterization+of+an+IL-4-responsive+region+in+the+immunoglobulin+heavy-chain+germline+epsilon+promoter.">Regulation of antibody class switching to IgE: characterization of an IL-4-responsive region in the immunoglobulin heavy-chain germline epsilon promoter.</a> Ann N Y Acad Sci. 764, 123-135 (1995).</li><li>Castigli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+expression+and+function+in+murine+B+cell+ontogeny.">CD40 expression and function in murine B cell ontogeny.</a> Int Immunol. 8, 405-411 (1996).</li><li>Ballantyne, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+recombination+of+a+switch+substrate+retrovector+in+CD40-+activated+B+lymphocytes:+implications+for+the+control+of+CH+gene+switch+recombination.">Efficient recombination of a switch substrate retrovector in CD40- activated B lymphocytes: implications for the control of CH gene switch recombination.</a> J Immunol. 161, 1336-1347 (1998).</li></ol>

Retrovirale Transduktion von Milz-B-Zellen, wie hier beschrieben und wie abgebildet in Abbildung 1 ist eine genetische Ansatz, die nützlich bei der Untersuchung der B-Lymphozyten ist, weil viele der Entwicklungs-Veranstaltungen in lymphopoesis durch Regulation der Transkription 1, 2 gesteuert werden. In den späteren Stadien der B-Zell-Reifung, Triggerung über CD40L ist essentiell für die Induktion der B-Zell-Wachstum, Eintritt in den Zellzyklus und Proliferation 11, 20. Wie in ...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>FCS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Atlanta Biologicals</td>
<td>S11550</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>22400</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>20012</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Red Blood Cell (RBC) lysis buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>R7757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD43 beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B Cell Complete Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various components</td>
<td>Various Components</td>
<td>RPMI, 15% FCS, 1% Non-Essential Amino Acids, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50&mu;M &beta;-Mercaptoethanol</td>
</tr>
<tr>
<td>IL-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-CD40</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Pharmigen</td>
<td>553787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>polybrene</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>107689 &#x2028;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chloroquine diphosphate salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>C6628</td>
<td>Used at 100mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Phoenix Eco cells (Murine)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Orbigen</td>
<td>RVC-10002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PE-Cy5-&alpha;-mouse-CD45R (B220)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>eBioscience</td>
<td>15-0452-81</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PE-&alpha;-mouse-IgG1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Pharmigen</td>
<td>A85-1</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

recombinant retroviral production and infection of b cells

Die transgenen Expression von Genen in eukaryotischen Zellen ist ein leistungsfähiges reverse genetische Ansatz, bei dem ein Gen von Interesse unter der Kontrolle eines heterologen Expressionssystem exprimiert wird, um die Analyse der resultierenden Phänotyp zu erleichtern. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um ein Gen, das normalerweise nicht in den Organismus gefunden auszudrücken, um eine mutierte Form des Gens Produkt zum Ausdruck bringen, oder zu überexprimieren eine dominant-negative Form des Genprodukts werden. Es ist besonders nützlich in der Studie des hämatopoetischen Systems, wo Transkriptionsregulation ist ein wichtiger Kontrollmechanismus in der Entwicklung und Differenzierung von B-Zellen 1, in 2-4 überprüft. Mausgenetik ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Erforschung der menschlichen Gene und Krankheiten. Eine vergleichende Analyse der Maus und menschlichen Genoms offenbart Erhaltung der Syntenie in mehr als 90% des Genoms 5. Außerdem ist ein Großteil der Technologie in Maus-Modellen verwendet werden für das Studium der menschlichen Gene, zum Beispiel Gendisruptionen und allelische Austausch 6 . Allerdings erfordert die Schaffung einer transgenen Maus ein hohes Maß an Ressourcen sowohl eine finanzielle und technische Natur. Mehrere Projekte wurden begonnen, um Bibliotheken von Knock-out-Maus-Stämme (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) oder Mutagenese induzierte Belastungen (RIKEN), die großen Anstrengungen und Zusammenarbeit 7 erfordern kompilieren. Daher ist es wünschenswert, erste Studie der Phänotyp eines gewünschten Gens in einer Zellkultur-Modell von primären Zellen vor fortschreitend bis zu einem Mausmodell. Retrovirale DNA integriert in die Wirts-DNA, vorzugsweise innerhalb oder in der Nähe Transkription Einheiten oder CpG-Inseln, die sich in stabilen und vererbbar Ausdruck des verpackten Gen von Interesse unter Vermeidung transkriptionellen Silencing 8 9. Die Gene werden dann unter der Kontrolle von einem hohen Wirkungsgrad retroviralen Promotor transkribiert, was zu einer hohen Effizienz der Transkription und Protein-Produktion. Daher kann retroviralen Expressionsvektor mit Zellen, die schwer zu transfizieren sind, verwendet werden, sofern die Zellen in einen aktiven Zustand während der Mitose. Da die strukturellen Gene des Virus innerhalb der Verpackungs-Zelllinie enthalten sind, enthalten die Expressionsvektoren verwendet werden, um das Gen von Interesse Klon keine strukturellen Gene des Virus, das sowohl die Möglichkeit der viralen Revertanten beseitigt und erhöht die Sicherheit bei der Arbeit mit viralen Überständen da keine infektiösen Virionen sind 10 hergestellt. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die rekombinante retrovirale Produktion und nachfolgende Infektion von Milz-B-Zellen. Nach der Isolierung werden die kultivierten Milzzellen mit Th abgeleitet Lymphokine und anti-CD40, die einen Ausbruch von B-Zell-Proliferation und Differenzierung 11 induziert stimuliert. Dieses Protokoll ist ideal für die Untersuchung der Ereignisse am späten B-Zell-Entwicklung und Differenzierung, wie B-Zellen aus der Milz nach der ersten hämatopoetischen Ereignisse, sondern vor antigenen Stimulation plasmazelluläre Differenzierung induzieren isoliert sind.

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Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

Ein effizientes System der Struktur-und Funktionsanalyse eines Gens in einer<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur der Milz B-Lymphozyten beschrieben. Diese Methode nutzt die Vorteile der rekombinanten retroviralen Produktion in ein Helfer frei, ecotrophic Verpackungs-Zelllinie. Stabile, vererbbare Expression eines Gens von Interesse innerhalb des primären Lymphozyten erreicht, was zu Generation Oberfläche Antikörper auf B-Zellen durchlaufen Klasse wechseln Rekombination.

Rekombinanten retroviralen Produktion und Infektion von B-Zellen

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Mausmodell der CD40-Aktivierung von B-Zellen

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Produktion und Titrierung von rekombinanten Adeno-assoziierte virale Vektoren

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Effiziente rekombinanten Parvovirus Produktion mit Hilfe von Adenovirus-abgeleiteten Systemen

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

Der Nachweis von IgE-Wahre exprimierenden Maus B Lineage Cells

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Erzeugung von rekombinanten humanen IgG monoklonalen Antikörpern aus Immortalisierte Sortiert B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Retrovirale Transduktion von Knochenmark-Progenitorzellen zu generieren T-Zell-Rezeptor Retrogenic Mäuse

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Targeting Cystein Thiole für in-vitro- standortspezifische Glykosylierung von rekombinanten Proteinen

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

"Leber-on-a-Chip" Kulturen der primäre Hepatozyten und Kupffer Zellen für Hepatitis B-Virus-Infektion

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...

Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production

Retrovirale Überexpression von CXCR4 auf murine B-1a-Zellen und Adoptivtransfer für gezielte B-1a-Zellmigration zur Knochenmark- und IgM-Produktion

As cell function is influenced by niche-specific factors in the cellular microenvironment, methods to dissect cell localization and migration can provide ...