Name: recombinant retroviral production and infection of b cells
Uploaded: 2011-02-18T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells at JoVE.com

CK נתמכת על ידי תוכנית קולומביה בוגרת אוניברסיטת. UB הוא בחור של לוקמיה לימפומה וחברה של אמריקה, זכה בפרס החוקר חדש מהקרן לחקר לוקמיה והוא נתמך על ידי הפקולטה באוניברסיטת קולומביה בניו הזנק וקרנות.

1. בידוד הטחול B-לימפוציטים וגירוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר spleens מתרומת זרע מחסר עכברים 12 בין 2-3 חודשים של גיל. הבידוד של הטחול מבוצעת בתנאים סטריליים האיברים נשמרים באופן זמני מלוחים למאגר קר פוספט (PBS) המכילה 15% נסיוב עוברי שור (FBS). </li...

<ol>
	<li>Bartholdy, B., Matthias, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+B+cell+development+and+function.">Transcriptional control of B cell development and function.</a> Gene. 327, 1-23 (2004).</li><li>Henderson, A., Calame, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+during+B+cell+development.">Transcriptional regulation during B cell development.</a> Annu Rev Immunol. 16, 163-200 (1998).</li><li>Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+plasticity+of+hematopoietic+cells.">Differentiation plasticity of hematopoietic cells.</a> Blood. 99, 3089-30101 (2002).</li><li>Xiao, C., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+control+in+the+immune+system:+basic+principles.">MicroRNA control in the immune system: basic principles.</a> Cell. 136, 26-36 (2009).</li><li>Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+sequencing+and+comparative+analysis+of+the+mouse+genome.">Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome.</a> Nature. 420, 520-562 (2002).</li><li>Griffiths, A. J. F., Miller, J. H., Suzuki, D. T., Lewontin, R. C., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Genetic Analysis. , (2000).</li><li>Gondo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+gene+targeting+in+the+mouse+for+functional+genomics.">Next-generation gene targeting in the mouse for functional genomics.</a> BMB Rep. 42, 315-3123 (2009).</li><li>Plachy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proviruses+selected+for+high+and+stable+expression+of+transduced+genes+accumulate+in+broadly+transcribed+genome+areas.">Proviruses selected for high and stable expression of transduced genes accumulate in broadly transcribed genome areas.</a> J Virol. 84, 4204-4211 (2010).</li><li>Felice, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+binding+sites+are+genetic+determinants+of+retroviral+integration+in+the+human+genome.">Transcription factor binding sites are genetic determinants of retroviral integration in the human genome.</a> PLoS One. 4, e4571-e4571 (2009).</li><li>Karavanas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+targeting+by+murine+retroviral+vectors.">Cell targeting by murine retroviral vectors.</a> Crit Rev Oncol Hematol. 28, 7-30 (1998).</li><li>Noelle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+39-kDa+protein+on+activated+helper+T+cells+binds+CD40+and+transduces+the+signal+for+cognate+activation+of+B+cells.">A 39-kDa protein on activated helper T cells binds CD40 and transduces the signal for cognate activation of B cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6550-6554 (1992).</li><li>Muramatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class+switch+recombination+and+hypermutation+require+activation-induced+cytidine+deaminase+(AID),+a+potential+RNA+editing+enzyme.">Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme.</a> Cell. 102, 553-563 (2000).</li><li>Yelle, J., Dion, M., Hamelin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+viral+DNA+in+optimal+culture+conditions.">Efficient transfection of mammalian cells with viral DNA in optimal culture conditions.</a> J Virol Methods. 7, 321-326 (1983).</li><li>Chen, C., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transformation+of+mammalian+cells+by+plasmid+DNA.">High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA.</a> Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).</li><li>Fagarasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+class+switching+and+differentiation+to+IgA-producing+cells+in+the+gut+lamina+propria.">In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria.</a> Nature. 413, 639-6343 (2001).</li><li>Basu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AID+antibody+diversification+enzyme+is+regulated+by+protein+kinase+A+phosphorylation.">The AID antibody diversification enzyme is regulated by protein kinase A phosphorylation.</a> Nature. 438, 508-5011 (2005).</li><li>McBride, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+class+switch+recombination+and+somatic+mutation+by+AID+phosphorylation.">Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation.</a> J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).</li><li>Barreto, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AID+from+bony+fish+catalyzes+class+switch+recombination.">AID from bony fish catalyzes class switch recombination.</a> J Exp Med. 202, 733-738 (2005).</li><li>Delphin, S., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+antibody+class+switching+to+IgE:+characterization+of+an+IL-4-responsive+region+in+the+immunoglobulin+heavy-chain+germline+epsilon+promoter.">Regulation of antibody class switching to IgE: characterization of an IL-4-responsive region in the immunoglobulin heavy-chain germline epsilon promoter.</a> Ann N Y Acad Sci. 764, 123-135 (1995).</li><li>Castigli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+expression+and+function+in+murine+B+cell+ontogeny.">CD40 expression and function in murine B cell ontogeny.</a> Int Immunol. 8, 405-411 (1996).</li><li>Ballantyne, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+recombination+of+a+switch+substrate+retrovector+in+CD40-+activated+B+lymphocytes:+implications+for+the+control+of+CH+gene+switch+recombination.">Efficient recombination of a switch substrate retrovector in CD40- activated B lymphocytes: implications for the control of CH gene switch recombination.</a> J Immunol. 161, 1336-1347 (1998).</li></ol>

התמרה retroviral של תאים B הטחול כפי שתואר כאן, כמתואר באיור 1 היא גישה גנטית שימושי במחקר של לימפוציטים-B כי רבים מן האירועים התפתחותיים lymphopoesis נשלטים על ידי תקנה תעתיק 1, 2. בשלבים מאוחרים יותר של ההתבגרות תא B, מפעילה באמצעות CD40L חיוני לזירוז הצמיחה תא B, הכניס...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>FCS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Atlanta Biologicals</td>
<td>S11550</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>22400</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>20012</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Red Blood Cell (RBC) lysis buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>R7757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD43 beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B Cell Complete Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various components</td>
<td>Various Components</td>
<td>RPMI, 15% FCS, 1% Non-Essential Amino Acids, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50&mu;M &beta;-Mercaptoethanol</td>
</tr>
<tr>
<td>IL-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-CD40</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Pharmigen</td>
<td>553787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>polybrene</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>107689 &#x2028;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chloroquine diphosphate salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>C6628</td>
<td>Used at 100mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Phoenix Eco cells (Murine)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Orbigen</td>
<td>RVC-10002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PE-Cy5-&alpha;-mouse-CD45R (B220)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>eBioscience</td>
<td>15-0452-81</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PE-&alpha;-mouse-IgG1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Pharmigen</td>
<td>A85-1</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

recombinant retroviral production and infection of b cells

הביטוי מהונדס של גנים בתאים אוקריוטים היא גישה חזקה גנטית הפוכה שבה הגן של עניין מתבטא בשליטה של ​​מערכת ביטוי Heterologous כדי להקל על ניתוח של פנוטיפ שהתקבל. גישה זו ניתן להשתמש כדי לבטא את הגן כי לא נמצא בדרך כלל האורגניזם, להביע את טופס מוטציה של מוצר הגן, או יתר להביע בצורה דומיננטית שלילית של המוצר גן. זה שימושי במיוחד במחקר של מערכת hematopoetic, שבה תקנה תעתיק הוא מנגנון בקרה מרכזי בהתפתחות והתמיינות של תאים B 1, הנסקרת ב 2-4. עכבר הגנטיקה הוא כלי רב עוצמה ללימוד גנים מחלות אנושיות. ניתוח השוואתי של העכבר הגנום האנושי מגלה שימור synteny של מעל 90% של הגנום 5. כמו כן, רוב הטכנולוגיה שבה נעשה שימוש במודלים של העכבר הוא ישים בחקר הגנים האנושיים, למשל, שיבושים גנים החלפת allelic 6 . עם זאת, יצירה של עכבר מהונדס דורש מידה רבה של משאבי הטבע הן כספי וטכני. מספר פרויקטים כבר החלו לאסוף ספריות של לדפוק את זני העכבר (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) או mutagenesis זנים המושרה (RIKEN), אשר דורשים בקנה מידה גדול מאמצים ושיתוף פעולה 7. לכן, רצוי קודם ללמוד את הפנוטיפ של הגן הרצוי במודל התא התרבות של תאים ראשוניים לפני שממשיך במודל של עכברים. ה-DNA retroviral משתלב ה-DNA המארח, רצוי בתוך או ליד יחידות שעתוק או איים CPG, והתוצאה היא יציבה תורשתי הביטוי של הגן ארוז עניין תוך הימנעות השתקה תעתיק 8 9. הגנים מתועתקים אז בשליטת מקדם יעילות גבוהה retroviral, וכתוצאה מכך יעילות גבוהה של שעתוק וייצור חלבונים. לכן, הביטוי retroviral ניתן להשתמש בתאים שקשה transfect, ובלבד התאים נמצאים במצב פעיל במהלך מיטוזה. מכיוון גנים מבניים של הנגיף נמצאים בתוך הקו תא אריזה, וקטורים ביטוי בשימוש לשבט את הגן של עניין אינם מכילים גנים מבניים של הנגיף, אשר שניהם מבטלת את האפשרות של revertants ויראלי מגביר את בטיחות של עבודה עם supernatants ויראלי כמו virions לא זיהומיות מיוצרים 10. כאן אנו מציגים פרוטוקול לייצור רקומביננטי retroviral זיהום הבאות של תאים B הטחול. לאחר הבידוד, התאים בתרבית הם הטחול מגורה עם lymphokines נגזר ה &#39;אנטי CD40, אשר מעוררת פרץ של התפשטות תאים B ו בידול 11. פרוטוקול זה הוא אידיאלי ללימוד אירועים המתרחשים מאוחר בהתפתחות התא B ו בידול, כמו תאים B מבודדים הטחול בעקבות האירועים hematopoetic הראשונית אבל לפני גירוי antigenic להשרות התמיינות plasmacytic.

Watch this Scientific Journal Video about Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells at JoVE.com

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

מערכת יעילה של מבנה וניתוח פונקציה של גן ב<em&gt; לשעבר vivo</em&gt; התרבות של לימפוציטים-B הטחול מתואר. שיטה זו מנצלת את ייצור רקומביננטי retroviral ב חופשית עוזר, קו אריזה ecotrophic התא. יציבה, תורשתי הביטוי של הגן של עניין בתוך לימפוציטים העיקרית היא להשיג מוביל לדור של נוגדנים על פני תאים B עוברת לעבור רקומבינציה בכיתה.

רקומביננטי הפקה זיהום retroviral של תאים B

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

דגם Murine של הפעלת-CD40 בתאי B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

ייצור Titering של Adeno הקשורים ווקטורים רקומביננטי ויראלי

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

ייצור יעיל Parvovirus רקומביננטי בעזרת adenovirus הנגזרות מערכות

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

איתור של True IgE להביע תאי Lineage העכבר B

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

דור של רקומביננטי אדם IgG נוגדנים חד שבטיים מתאים הממוינים B הונצחו

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Retroviral התמרה של ובתאים מח עצם כדי ליצור תאי T קולטן Retrogenic עכברים

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

מכוונת ציסטאין תיולים במבחנה גליקוזילציה בייעודי לאתר של חומרים

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

"כבד-על-שבב" תרבויות של ראשי Hepatocytes ותאים Kupffer על זיהום בנגיף הפטיטיס B

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...

Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production

Retroviral ביטוי יתר של CXCR4 על מורנה ב-1a תאים והעברה המאמצת עבור B-1a תא הגירה במח העצם ו IgM הפקה

As cell function is influenced by niche-specific factors in the cellular microenvironment, methods to dissect cell localization and migration can provide ...