Name: recombinant retroviral production and infection of b cells
Uploaded: 2011-02-18T16:00:00
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CKは、コロンビア大学大学院のプログラムによってサポートされています。 UBは、アメリカの白血病とリンパ腫協会、白血病研究基金からの新しい研究者賞の受信者のフェローであり、コロンビア大学新学部スタートアップ資金によってサポートされています。

1。脾臓B -リンパ球の単離と刺激<ol><li>年齢の2〜3ヶ月の間にAID欠損マウスから脾臓を12を回収する。脾臓の単離は無菌条件下で行われ、臓器が一時的に15パーセントウシ胎児血清（FBS）を含む冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に保存されています。 </li><li>脾臓を無菌組織培養フードに移し、2.5％FBSを添加したPBS 5mLにホモジナイズする。 15 mLのファルコンチューブにホモジネートを移す...

<ol>
	<li>Bartholdy, B., Matthias, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+B+cell+development+and+function.">Transcriptional control of B cell development and function.</a> Gene. 327, 1-23 (2004).</li><li>Henderson, A., Calame, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+during+B+cell+development.">Transcriptional regulation during B cell development.</a> Annu Rev Immunol. 16, 163-200 (1998).</li><li>Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+plasticity+of+hematopoietic+cells.">Differentiation plasticity of hematopoietic cells.</a> Blood. 99, 3089-30101 (2002).</li><li>Xiao, C., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+control+in+the+immune+system:+basic+principles.">MicroRNA control in the immune system: basic principles.</a> Cell. 136, 26-36 (2009).</li><li>Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+sequencing+and+comparative+analysis+of+the+mouse+genome.">Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome.</a> Nature. 420, 520-562 (2002).</li><li>Griffiths, A. J. F., Miller, J. H., Suzuki, D. T., Lewontin, R. C., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Genetic Analysis. , (2000).</li><li>Gondo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+gene+targeting+in+the+mouse+for+functional+genomics.">Next-generation gene targeting in the mouse for functional genomics.</a> BMB Rep. 42, 315-3123 (2009).</li><li>Plachy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proviruses+selected+for+high+and+stable+expression+of+transduced+genes+accumulate+in+broadly+transcribed+genome+areas.">Proviruses selected for high and stable expression of transduced genes accumulate in broadly transcribed genome areas.</a> J Virol. 84, 4204-4211 (2010).</li><li>Felice, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+binding+sites+are+genetic+determinants+of+retroviral+integration+in+the+human+genome.">Transcription factor binding sites are genetic determinants of retroviral integration in the human genome.</a> PLoS One. 4, e4571-e4571 (2009).</li><li>Karavanas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+targeting+by+murine+retroviral+vectors.">Cell targeting by murine retroviral vectors.</a> Crit Rev Oncol Hematol. 28, 7-30 (1998).</li><li>Noelle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+39-kDa+protein+on+activated+helper+T+cells+binds+CD40+and+transduces+the+signal+for+cognate+activation+of+B+cells.">A 39-kDa protein on activated helper T cells binds CD40 and transduces the signal for cognate activation of B cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6550-6554 (1992).</li><li>Muramatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class+switch+recombination+and+hypermutation+require+activation-induced+cytidine+deaminase+(AID),+a+potential+RNA+editing+enzyme.">Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme.</a> Cell. 102, 553-563 (2000).</li><li>Yelle, J., Dion, M., Hamelin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+viral+DNA+in+optimal+culture+conditions.">Efficient transfection of mammalian cells with viral DNA in optimal culture conditions.</a> J Virol Methods. 7, 321-326 (1983).</li><li>Chen, C., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transformation+of+mammalian+cells+by+plasmid+DNA.">High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA.</a> Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).</li><li>Fagarasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+class+switching+and+differentiation+to+IgA-producing+cells+in+the+gut+lamina+propria.">In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria.</a> Nature. 413, 639-6343 (2001).</li><li>Basu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AID+antibody+diversification+enzyme+is+regulated+by+protein+kinase+A+phosphorylation.">The AID antibody diversification enzyme is regulated by protein kinase A phosphorylation.</a> Nature. 438, 508-5011 (2005).</li><li>McBride, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+class+switch+recombination+and+somatic+mutation+by+AID+phosphorylation.">Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation.</a> J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).</li><li>Barreto, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AID+from+bony+fish+catalyzes+class+switch+recombination.">AID from bony fish catalyzes class switch recombination.</a> J Exp Med. 202, 733-738 (2005).</li><li>Delphin, S., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+antibody+class+switching+to+IgE:+characterization+of+an+IL-4-responsive+region+in+the+immunoglobulin+heavy-chain+germline+epsilon+promoter.">Regulation of antibody class switching to IgE: characterization of an IL-4-responsive region in the immunoglobulin heavy-chain germline epsilon promoter.</a> Ann N Y Acad Sci. 764, 123-135 (1995).</li><li>Castigli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+expression+and+function+in+murine+B+cell+ontogeny.">CD40 expression and function in murine B cell ontogeny.</a> Int Immunol. 8, 405-411 (1996).</li><li>Ballantyne, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+recombination+of+a+switch+substrate+retrovector+in+CD40-+activated+B+lymphocytes:+implications+for+the+control+of+CH+gene+switch+recombination.">Efficient recombination of a switch substrate retrovector in CD40- activated B lymphocytes: implications for the control of CH gene switch recombination.</a> J Immunol. 161, 1336-1347 (1998).</li></ol>

ここで説明すると、 図1に示すように、脾臓B細胞のレトロウイルス導入はlymphopoesisの発達のイベントの多くは転写制御1、2によって制御されるため、B -リンパ球の研究に有用な遺伝学的ア ​​プローチです。 B細胞の成熟の後の段階では、CD40Lを介してトリガするB細胞増殖、細胞周期への参入、および増殖11、20の誘導に必須である。 図2に示すように...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>FCS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Atlanta Biologicals</td>
<td>S11550</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>22400</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>20012</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Red Blood Cell (RBC) lysis buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>R7757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD43 beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B Cell Complete Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various components</td>
<td>Various Components</td>
<td>RPMI, 15% FCS, 1% Non-Essential Amino Acids, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50&mu;M &beta;-Mercaptoethanol</td>
</tr>
<tr>
<td>IL-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-CD40</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Pharmigen</td>
<td>553787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>polybrene</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>107689 &#x2028;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chloroquine diphosphate salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>C6628</td>
<td>Used at 100mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Phoenix Eco cells (Murine)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Orbigen</td>
<td>RVC-10002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PE-Cy5-&alpha;-mouse-CD45R (B220)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>eBioscience</td>
<td>15-0452-81</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PE-&alpha;-mouse-IgG1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Pharmigen</td>
<td>A85-1</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

recombinant retroviral production and infection of b cells

真核細胞における遺伝子のトランスジェニック発現は、目的の遺伝子が生じる表現型の解析を容易にするために異種発現系の制御下で発現されている強力な逆遺伝学的アプローチです。このアプローチは、遺伝子産物の変異型を表現するために、または遺伝子産物のドミナントネガティブ型を過剰発現するように、通常の生物で発見されていない遺伝子を発現させることができる。それは転写調節が2-4でレビューB細胞1の分化における主要な制御機構である造血系の研究では特に便利です。 マウス遺伝学は、人間の遺伝子と疾病の研究のための強力なツールです。マウスとヒトのゲノムの比較解析は、ゲノム5の90％以上のシンテニーの保全を明らかにする。また、多くのマウスモデルで使用されている技術のは、例えば、遺伝子の混乱と対立遺伝子交換6ヒト遺伝子の研究にも適用可能であるただし 、トランスジェニックマウスの作成 ​​は、財政的、技術的性質の両方のリソースが大量に必要になります。いくつかのプロジェクトでは、ノックアウトマウス系統（KOMP、EUCOMM、NorCOMM）または大規模な努力とコラボレーション7を必要とする特異的変異誘発株（理研）、のライブラリをコンパイルし始めている。したがって、それは最初のマウスモデルに進行する前に、初代培養細胞の細胞培養モデルにおける所望の遺伝子の表現型を検討することが望ましい。 レトロウイルスDNAは安定した結果、好ましくは転写単位またはCpGアイランド内、または近くに、宿主のDNAに統合されており、転写サイレンシング8 9を避けながら、関心のパッケージ化遺伝子の発現を遺伝。遺伝子は、転写とタンパク質生産の高効率で、その結果、高効率レトロウイルスプロモーターの制御下に転写されます。このため、レトロウイルス発現はトランスフェクションが困難な細胞に使用することができる、細胞が有糸分裂中にアクティブな状態で提供される。ウイルスの構造遺伝子をパッケージング細胞株内に含まれているため、目的の遺伝子をクローニングするために用いられる発現ベクターは、両方のウイルスの復帰の可能性を排除し、ウイルス上清での作業の安全性を高めるウイルス、のない構造遺伝子が含まれていないは感染性ビリオンは10を生成されませんように。 ここでは、組換えレトロウイルスの生産と脾臓B細胞のその後の感染のためのプロトコルを提示する。単離後、培養脾臓細胞はB細胞の増殖と分化11のバーストを誘導するのTh由来のリンホカイ ​​ンと抗CD40で刺激される。このプロトコルは、B細胞は形質細胞分化を誘導するが、前の抗原刺激に対する初期造血のイベントに続いて脾臓から分離されているとして、後期B細胞の発達と分化に発生するイベントの研究に最適です。

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Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

の遺伝子の構造と機能解析の効率的なシステム<em&gt;生体外で</em脾臓B -リンパ球の&gt;文化が説明されています。このメソッドは、ヘルパーフリー、ecotrophicパッケージング細胞株における組換えレトロウイルスの生産の利点を取ります。安定した、クラススイッチ組み換えを受けたB細胞上の表面の抗体の産生につながる達成される一次リンパ球内で目的遺伝子の発現を遺伝。

B細胞の組換えレトロウイルスの生産と感染症

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

B細胞のCD40 -活性化のモデルマウス

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

マウスT細胞におけるT細胞受容体のレトロウイルス導入

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

組換えアデノ随伴ウイルスベクターの産生と力価測定

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

アデノウイルス由来のシステムの助けを借りて効率的な組換えパルボウイルスの生産

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

真のIgE発現するマウスB系統細胞の検出

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

不死化ソートB細胞からの組換えヒトIgGモノクローナル抗体の作製

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

骨髄前駆細胞のレトロウイルス形質導入は、T細胞受容体Retrogenicマウスを生成するために、

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

組換えタンパク質の部位特異的糖体外のシステインのチオール基を対象と

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初代肝細胞とクッパー細胞 B 型肝炎ウイルス感染の「肝臓-オン-チップ」文化

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...

Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production

マウスB-1a細胞におけるCXCR4のレトロウイルス過剰発現と骨髄およびIgM産生への標的B-1a細胞の移行のための養子転移

As cell function is influenced by niche-specific factors in the cellular microenvironment, methods to dissect cell localization and migration can provide ...