Name: recombinant retroviral production and infection of b cells
Uploaded: 2011-02-18T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells at JoVE.com

CK stöds av Columbia University Graduate program. UB är Fellow vid leukemi och lymfom Society of America, mottagaren av New Investigator Award från leukemi Research Foundation och stöds av Columbia University ny fakultet starta fonder.

1. Mjälten B-lymfocyter Isolering och stimulans <ol><li> Skörda mjälte från AID-brist möss 12 mellan 2-3 månaders ålder. Isolering av mjälte utförs under sterila förhållanden och organen hålls tillfälligt i kallt fosfatbuffert saltlösning (PBS) som innehåller 15% fetalt bovint serum (FBS). </li><li> Mjälten överförs sedan till en steril vävnadsodling huva och homogeniseras i 5 mL PBS kompletterad med 2,5% FBS. Överför homogenatet till en 15 ml Falcon rör. </li><li> Centrifugera det hom...

<ol>
	<li>Bartholdy, B., Matthias, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+B+cell+development+and+function.">Transcriptional control of B cell development and function.</a> Gene. 327, 1-23 (2004).</li><li>Henderson, A., Calame, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+during+B+cell+development.">Transcriptional regulation during B cell development.</a> Annu Rev Immunol. 16, 163-200 (1998).</li><li>Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+plasticity+of+hematopoietic+cells.">Differentiation plasticity of hematopoietic cells.</a> Blood. 99, 3089-30101 (2002).</li><li>Xiao, C., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+control+in+the+immune+system:+basic+principles.">MicroRNA control in the immune system: basic principles.</a> Cell. 136, 26-36 (2009).</li><li>Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+sequencing+and+comparative+analysis+of+the+mouse+genome.">Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome.</a> Nature. 420, 520-562 (2002).</li><li>Griffiths, A. J. F., Miller, J. H., Suzuki, D. T., Lewontin, R. C., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Genetic Analysis. , (2000).</li><li>Gondo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+gene+targeting+in+the+mouse+for+functional+genomics.">Next-generation gene targeting in the mouse for functional genomics.</a> BMB Rep. 42, 315-3123 (2009).</li><li>Plachy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proviruses+selected+for+high+and+stable+expression+of+transduced+genes+accumulate+in+broadly+transcribed+genome+areas.">Proviruses selected for high and stable expression of transduced genes accumulate in broadly transcribed genome areas.</a> J Virol. 84, 4204-4211 (2010).</li><li>Felice, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+binding+sites+are+genetic+determinants+of+retroviral+integration+in+the+human+genome.">Transcription factor binding sites are genetic determinants of retroviral integration in the human genome.</a> PLoS One. 4, e4571-e4571 (2009).</li><li>Karavanas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+targeting+by+murine+retroviral+vectors.">Cell targeting by murine retroviral vectors.</a> Crit Rev Oncol Hematol. 28, 7-30 (1998).</li><li>Noelle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+39-kDa+protein+on+activated+helper+T+cells+binds+CD40+and+transduces+the+signal+for+cognate+activation+of+B+cells.">A 39-kDa protein on activated helper T cells binds CD40 and transduces the signal for cognate activation of B cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6550-6554 (1992).</li><li>Muramatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class+switch+recombination+and+hypermutation+require+activation-induced+cytidine+deaminase+(AID),+a+potential+RNA+editing+enzyme.">Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme.</a> Cell. 102, 553-563 (2000).</li><li>Yelle, J., Dion, M., Hamelin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+viral+DNA+in+optimal+culture+conditions.">Efficient transfection of mammalian cells with viral DNA in optimal culture conditions.</a> J Virol Methods. 7, 321-326 (1983).</li><li>Chen, C., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transformation+of+mammalian+cells+by+plasmid+DNA.">High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA.</a> Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).</li><li>Fagarasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+class+switching+and+differentiation+to+IgA-producing+cells+in+the+gut+lamina+propria.">In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria.</a> Nature. 413, 639-6343 (2001).</li><li>Basu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AID+antibody+diversification+enzyme+is+regulated+by+protein+kinase+A+phosphorylation.">The AID antibody diversification enzyme is regulated by protein kinase A phosphorylation.</a> Nature. 438, 508-5011 (2005).</li><li>McBride, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+class+switch+recombination+and+somatic+mutation+by+AID+phosphorylation.">Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation.</a> J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).</li><li>Barreto, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AID+from+bony+fish+catalyzes+class+switch+recombination.">AID from bony fish catalyzes class switch recombination.</a> J Exp Med. 202, 733-738 (2005).</li><li>Delphin, S., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+antibody+class+switching+to+IgE:+characterization+of+an+IL-4-responsive+region+in+the+immunoglobulin+heavy-chain+germline+epsilon+promoter.">Regulation of antibody class switching to IgE: characterization of an IL-4-responsive region in the immunoglobulin heavy-chain germline epsilon promoter.</a> Ann N Y Acad Sci. 764, 123-135 (1995).</li><li>Castigli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+expression+and+function+in+murine+B+cell+ontogeny.">CD40 expression and function in murine B cell ontogeny.</a> Int Immunol. 8, 405-411 (1996).</li><li>Ballantyne, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+recombination+of+a+switch+substrate+retrovector+in+CD40-+activated+B+lymphocytes:+implications+for+the+control+of+CH+gene+switch+recombination.">Efficient recombination of a switch substrate retrovector in CD40- activated B lymphocytes: implications for the control of CH gene switch recombination.</a> J Immunol. 161, 1336-1347 (1998).</li></ol>

Retroviral transduktion av mjälten B-celler som beskrivs här och som avbildas i figur 1 är en genetisk metod som är användbar i studiet av B-lymfocyter eftersom många av de utvecklings-evenemang i lymphopoesis styrs av transkriptionell reglering 1, 2. I de senare stadierna av B cellmognaden triggning via CD40L är nödvändig för induktion av B-cellernas tillväxt, tas i cellcykeln och spridning 11, 20. Som visas i figur 2, kan B-celler stimuleras in vitro m...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>FCS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Atlanta Biologicals</td>
<td>S11550</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>22400</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>20012</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Red Blood Cell (RBC) lysis buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>R7757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD43 beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B Cell Complete Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various components</td>
<td>Various Components</td>
<td>RPMI, 15% FCS, 1% Non-Essential Amino Acids, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50&mu;M &beta;-Mercaptoethanol</td>
</tr>
<tr>
<td>IL-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-CD40</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Pharmigen</td>
<td>553787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>polybrene</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>107689 &#x2028;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chloroquine diphosphate salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>C6628</td>
<td>Used at 100mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Phoenix Eco cells (Murine)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Orbigen</td>
<td>RVC-10002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PE-Cy5-&alpha;-mouse-CD45R (B220)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>eBioscience</td>
<td>15-0452-81</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PE-&alpha;-mouse-IgG1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Pharmigen</td>
<td>A85-1</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

recombinant retroviral production and infection of b cells

De transgena uttrycket av gener i eukaryota celler är en kraftfull omvänd genetisk strategi, där en gen av intresse uttrycks under kontroll av en heterologa uttryck system för att underlätta analysen av den resulterande fenotyp. Denna metod kan användas för att uttrycka en gen som inte normalt finns i organismen, för att uttrycka en muterad form av en gen produkt, eller över-uttrycka en dominant-negativa formen av genen produkten. Det är särskilt användbart i studiet av hematopoetisk system, där transkriptionell reglering är en viktig kontrollmekanism i utveckling och differentiering av B-celler 1, över 2-4. Musen genetik är ett kraftfullt verktyg för studier av mänskliga gener och sjukdomar. En jämförande analys av musens och människans arvsmassa avslöjar bevarande av synteny i över 90% av genomet 5. Dessutom är mycket av den teknik som används i musmodeller som gäller för studiet av mänskliga gener, exempelvis gen störningar och allela ersättare 6 . kräver dock skapandet av en transgen mus en hel del resurser av både en ekonomisk och teknisk natur. Flera projekt har börjat sammanställa bibliotek slå ut musstammar (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) eller mutagenes inducerad stammar (RIKEN), som kräver stora insatser och samverkan 7. Därför är det önskvärt att först studera fenotyp av en önskad gen i en cellkultur modell av galvaniska element innan du fortsätter till en musmodell. Retroviral DNA integreras i den mottagande DNA, helst inom eller nära transkription enheter eller CpG öar, vilket resulterar i stabil och ärftliga uttryck för den paketerade genen av intresse och samtidigt undvika transkriptionell tysta 8 9. Generna är sedan skrivits under kontroll av en hög effektivitet retrovirus promotor, vilket resulterar i en hög effektivitet i transkription och protein produktion. Därför kan retrovirus uttryck användas med celler som är svåra att transfektera, förutsatt att cellerna är i aktivt läge under mitosen. Eftersom den strukturella generna av viruset finns i förpackningen cellinje, uttrycket vektorer som används för att klona genen av intresse innehåller inga strukturella gener av virus, som både eliminerar risken för virus revertants och ökar säkerheten i arbetet med viral supernatanterna eftersom ingen smittsam virioner produceras 10. Här presenterar vi ett protokoll för rekombinant retrovirus produktion och efterföljande infektion av mjältens B-celler. Efter isolering är de odlade mjälten cellerna stimuleras med Th härrör lymfokiner och anti-CD40, som framkallar en explosion av B celltillväxt och differentiering 11. Detta protokoll är idealisk för att studera händelser som inträffar sent i B-celler utveckling och differentiering, liksom B-celler är isolerade från mjälten följande inledande hematopoetisk händelser men före antigen stimulering för att framkalla plasmacytic differentiering.

Watch this Scientific Journal Video about Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells at JoVE.com

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

Ett effektivt system för uppbyggnad och funktion analys av en gen i en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur av mjälten B-lymfocyter beskrivs. Denna metod tar fördel av rekombinant retrovirus produktion i en hjälpare fri, ecotrophic förpackning cellinje. Stabil, ärftliga uttryck av en gen av intresse inom primärvården lymfocyter uppnås leder till generation av yta antikroppar på B-celler som genomgår rekombination klass switch.

Rekombinant retroviral Produktion och infektion av B-celler

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Murina Modell av CD40-aktivering av B-celler

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retroviral Transduction av T-cell receptorer i Mus T-celler

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Produktion och Titering av rekombinanta Adeno-associerad virala vektorer

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Effektiv Rekombinant Parvovirus produktion med hjälp av adenovirus-härledda Systems

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

Upptäckt av True IgE-uttryck Mus B-celler

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Framställning av rekombinant human IgG monoklonala antikroppar från Immortaliserade Sorterat B-celler

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Retroviral Transduction av benmärgsstamceller för att generera T-cellreceptor Retrogenic Möss

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Inriktning cystein tioler för in Vitro platsspecifika Glycosylation av rekombinanta proteiner

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

”Levern-på-ett-Chip” kulturer av primära hepatocyter och Kupffers celler för hepatit B virusinfektion

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...

Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production

Retroviral överuttryck av CXCR4 på Murine B-1a celler och adoptivöverföring för riktad B-1a Cell Migration till benmärgen och IgM Produktion

As cell function is influenced by niche-specific factors in the cellular microenvironment, methods to dissect cell localization and migration can provide ...