Name: nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons
Uploaded: 2011-01-24T17:50:00
Duration: 15 min 40 s
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सभी प्रक्रियाओं जानवर की देखभाल पर विस्कॉन्सिन समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया और NIH दिशा निर्देशों के अनुसार में थे. हम उसे Nucleofector डिवाइस के उदार उपयोग के लिए डॉ. कैथरीन Kalil धन्यवाद. हम भी सेंध प्रोटोकॉल पर टिप्पणियों के लिए प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद. इस काम EWD R01 NS064014 एनआईएच, दाना फाउंडेशन और व्हाइटहॉल फाउंडेशन के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया क्रिस्टोफर Viesselmann, जेसन Ballweg और डेरेक Lumbard इस पत्र के लिए समान रूप से योगदान दिया.

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	<li>Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G., Goslin, K., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13.">Chapter 13.</a> Culturing Nerve Cells. , 339-370 (1998).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+and+movement+of+microtubules+in+axonal+growth+cones+and+developing+interstitial+branches.">Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches.</a> J Neurosci. 19, 8894-8908 (1999).</li><li>Dent, E. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+neuronal+cytoskeleton.">Dynamic imaging of neuronal cytoskeleton.</a> Methods Enzymol. 361, 390-407 (2003).</li><li>Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodia+are+required+for+cortical+neurite+initiation.">Filopodia are required for cortical neurite initiation.</a> Nat Cell Biol. 9, 1347-1359 (2007).</li><li>Hu, X., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+dynamic+microtubule+invasion+of+dendritic+spines.">Activity-dependent dynamic microtubule invasion of dendritic spines.</a> J Neurosci. 28, 13094-13105 (2008).</li><li>Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+Ena/VASP+proteins+for+filopodia+formation+in+neurons+and+in+function+downstream+of+netrin-1.">Critical role of Ena/VASP proteins for filopodia formation in neurons and in function downstream of netrin-1.</a> Neuron. 42, 37-49 (2004).</li><li>Meberg, P. J., Miller, M. W., Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7.">Chapter 7.</a> Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , 112-129 (2003).</li><li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li><li>Zeitelhofer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transfection+of+mammalian+neurons+via+nucleofection.">High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection.</a> Nat Protoc. 2, 1692-1704 (2007).</li></ol>

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

संवर्धन भ्रूण hippocampal और cortical माउस न्यूरॉन्स के लिए इस प्रोटोकॉल बैंकर प्रोटोकॉल, जो चूहे न्यूरॉन्स 1,2 का उपयोग करता है की एक संशोधन के रूप में विकसित किया गया था. हम संवर्धन माउस और हम्सटर न्यूरॉन्स के लिए 3,4,5,6,7 में अच्छी तरह के रूप में इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है . इस प्रोटोकॉल दोनों hippocampal और neocortical न्यूरॉन्स के लिए समान रूप से अच्छी तरह से काम करता है और एक Meberg और 8 मिलर द्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल के समान है. आम तौर पर, हम लंबे समय तक संस्कृति के लिए hippocampal न्यूरॉन्स का उपयोग करें, क्योंकि वे अच्छी तरह से विशेषता है और एक और अधिक मॉडल प्रणाली की स्थापना की. इसके अलावा, वे neocortex से न्यूरॉन्स की एक और अधिक सजातीय आबादी शामिल होने की संभावना हैं. हालांकि, इस प्रोटोकॉल का उपयोग भी जीवित है और इसी तरह अंतर (अप्रकाशित डेटा) neocortical न्यूरॉन्स सुसंस्कृत. हम नियमित रूप से अल्पकालिक संस्कृति के लिए hippocampal और neocortical न्यूरॉन्स का उपयोग करें. Neocortex के विच्छेदन भी hippocampal विच्छेदन (hippocampi की जोड़ी प्रति 2.5x10 5 न्यूरॉन्स) है, जो यह उदाहरण के लिए पश्चिमी सोख्ता है, के लिए सामग्री की एक बेहतर विकल्प बनाता है की तुलना में काफी अधिक न्यूरॉन्स (cortices की जोड़ी प्रति 1.5x10 6 न्यूरॉन्स) में परिणाम है. किसी भी प्राथमिक संस्कृति के साथ के रूप में, यह आवश्यक है के लिए समय है कि यह पशु की मौत से कोशिकाओं के चढ़ाना लेता कम से कम. यह आम तौर पर 10-20 dissections लेने के लिए विच्छेदन और चढ़ाना में लगातार तेजी से हो जाएगा. इसके अलावा, जब Lonza Nucleofector के साथ काम, यह electroporation प्रक्रिया के दौरान जल्दी से काम करने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में न्यूरॉन्स की व्यवहार्यता तेजी से कम हो जाती है अगर वे nucleofection बफर में छोड़ दिया जाता है. ज्यादातर हमारे इमेजिंग के कुल आंतरिक reflectance प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRFM) के साथ आयोजित किया जाता है. माइक्रोस्कोपी के इस प्रकार केवल इमेजिंग coverslip परे कई सौ नैनोमीटर में सक्षम है. इसलिए, न्यूरॉन्स के क्षेत्रों है कि छवि हम अक्सर, axonal विकास शंकु और वृक्ष के समान spines, सीधे coverslip करने के लिए पालन किया जाना चाहिए. इस प्रकार, हम कम घनत्व संस्कृतियों है कि लंबी अवधि संस्कृति के लिए glial खिला की आवश्यकता का उपयोग करें. हम उच्च घनत्व संस्कृतियों का इस्तेमाल किया है (&gt; 2x10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी), glial फीडर परतों के बिना, लंबे समय तक संस्कृतियों के लिए और पाया है कि वे थोड़ा खिला के साथ बहुत अच्छी तरह से जीवित रहते हैं. हालांकि, इन न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान spines बार बार भी सब्सट्रेट से दूर दूर TIRFM में छवि के लिए कर रहे हैं, हालांकि वे व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी या confocal माइक्रोस्कोपी के साथ आसानी से पता लगाया जा सकता है. हमारे अध्ययन के अधिकांश में हम चढ़ाना पहले न्यूरॉन्स transfect, और संस्कृति में तीन महीने के लिए के लिए fluorescently लेबल प्रोटीन imaged. Fluorescently लेबल प्रोटीन की इस अभिव्यक्ति दीर्घकालिक हमें विश्वास देता है कि डीएनए (1 2μg) की कम मात्रा का उपयोग करके हम overexpression कलाकृतियों न्यूरॉन्स में उत्पादन कर रहे हैं. हालांकि, इस प्रक्रिया को भी प्रोटीन की overexpression का अध्ययन करने के लिए अगर डीएनए की उच्च मात्रा (10 20μg) का उपयोग किया जाता है के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. plasmids है कि हम न्यूरॉन्स transfect उपयोग आमतौर पर EGFP या mCherry संलयन प्रोटीन होते हैं, हालांकि हम भी DsRed2 या अकेले EGFP के साथ neuronal cytoplasm लेबल. यह electroporation तकनीक vectors की एक संख्या के साथ अच्छी तरह से काम करता है. पाली हम plasmids कि सीएमवी बढ़ाने और बीटा ग्लोबिन के साथ एक प्रमोटर β-actin होते हैं पसंद करते हैं एक पूंछ (pCAGGs या pCAX plasmids) 9, अभिव्यक्ति की अपेक्षाकृत उच्च स्तर के कारण, और तथ्य यह है कि वे न्यूरॉन्स द्वारा अच्छी तरह सहन कर रहे हैं दोनों छोटी और लंबी अवधि संस्कृति में. आम तौर पर, प्रोटीन चढ़ाना के बारे में 4 घंटे के भीतर व्यक्त और 10 10-24hrs के भीतर इमेजिंग के लिए पर्याप्त स्तर तक पहुँचने शुरू करते हैं. हम सफलतापूर्वक अल्पावधि संस्कृतियों में सीएमवी प्रमोटर संचालित plasmids का इस्तेमाल किया है, लेकिन पाया गया है कि वे overexpression की उच्च स्तर के कारण है कि लंबी अवधि संस्कृति में न्यूरॉन्स को मार सकते हैं. फिर भी, हमने पाया है कि कम घनत्व संस्कृतियों के glial कंडीशनिंग सीएमवी प्रमोटर संचालित plasmids के साथ ट्रांसफ़ेक्ट न्यूरॉन्स के अस्तित्व के साथ मदद करता है, उच्च घनत्व (गैर - glial खिलाया) संस्कृतियों की तुलना में,.

* अधिकांश अभिकर्मकों कि हम दुकान -80 पर डिग्री सेल्सियस -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है के रूप में अच्छी तरह से. उन्हें -80 पर भंडारण ° सी उनकी शैल्फ जीवन और थोड़ा और अधिक सुसंगत संस्कृतियों में परिणाम lengthens.

nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons

Hippocampal और cortical न्यूरॉन्स बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है केंद्रीय तंत्रिका (सीएनएस) neuronal ध्रुवीकरण प्रणाली, अक्षतंतु / dendrite परिणाम, और synapse गठन और समारोह का अध्ययन. संवर्धन इन न्यूरॉन्स की एक और लाभ यह है कि वे आसानी से फूट डालना, विशिष्ट axons और dendrites बहुत कम घनत्व पर एक दो आयामी सब्सट्रेट पर, बनाने. यह गुण उन्हें neuronal विकास के कई पहलुओं का निर्धारण करने के लिए अत्यंत उपयोगी बना दिया है. इसके अलावा, इन न्यूरॉन्स के लिए glial कंडीशनिंग प्रदान करके वे विकसित करने के लिए जारी, कार्यात्मक synaptic कनेक्शन बनाने और संस्कृति में कई महीनों के लिए जीवित. इस प्रोटोकॉल में हम टुकड़े करना करने के लिए एक तकनीक, संस्कृति और transfect भ्रूण माउस hippocampal और cortical न्यूरॉन्स रूपरेखा. अभिकर्मक न्यूरॉन्स में nucleofection के माध्यम से चढ़ाना पहले डीएनए electroporating द्वारा पूरा किया है. इस प्रोटोकॉल fluorescently टैग संलयन विकास (~ 4-8hrs चढ़ाना के बाद) ध्रुवीकरण, अक्षतंतु परिणाम और शाखाओं में बंटी के दौरान प्रोटीन की गतिशीलता और समारोह का अध्ययन में जल्दी प्रोटीन व्यक्त का लाभ है. हम यह भी पता चला है कि चढ़ाना पहले इस एक अभिकर्मक न्यूरॉन (&gt; संस्कृति में 2 महीने) के जीवन भर इमेजिंग के लिए उपयुक्त स्तर पर fluorescently टैग संलयन प्रोटीन अभिव्यक्ति का कहना है. इस प्रकार, इस पद्धति neuronal समारोह के छोटे या कोई व्यवधान के साथ प्रोटीन और CNS विकास में स्थानीयकरण समारोह के अध्ययन के लिए उपयोगी है.

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Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

इस प्रोटोकॉल के लिए काटना आवश्यक कदम रूपरेखा, electroporation और संस्कृति माउस hippocampal और cortical न्यूरॉन्स के माध्यम से transfect. लघु अवधि संस्कृतियों अक्षतंतु परिणाम और मार्गदर्शन के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि लंबी अवधि के संस्कृतियों synaptogenesis और वृक्ष के समान रीढ़ की हड्डी विश्लेषण के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Nucleofection और भ्रूण माउस hippocampal और cortical न्यूरॉन्स के प्राथमिक संस्कृति

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

विच्छेदन और भ्रूणीय स्पाइनल कॉर्ड से Commissural न्यूरॉन्स की संस्कृति

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

Utero में electroporation cortical न्यूरॉन्स के सबसेट में जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए प्राथमिक Neuronal संस्कृति द्वारा पीछा

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

प्राथमिक चूहा cortical न्यूरॉन्स और Glia Bilaminar सह संस्कृति

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

अलगाव और जन्म के पूर्व चूहे से hippocampal न्यूरॉन्स की संस्कृति

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

अलगाव और माउस Cortical Astrocytes की संस्कृति

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

प्राथमिक hippocampal न्यूरॉन्स की कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

माउस डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के प्राथमिक संस्कृति

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

भ्रूण कृंतक दिमाग से प्राथमिक Mesencephalic डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के अलगाव, संस्कृति और लंबी अवधि के रखरखाव

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

कम घनत्व प्राथमिक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन संस्कृति

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

अलगाव और भ्रूण माउस तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं की संस्कृति

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...