Name: pseudomonas aeruginosa and saccharomyces cerevisiae biofilm in flow cells
Uploaded: 2011-01-15T17:00:00
Duration: 17 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells at JoVE.com

1. האסיפה של מערכת תא זרימה עם כל הרכיבים מערכת זרימה התאספו כוללת: צינורות autoclavable, מלכודות בועה, בינוני / בקבוק פסולת ותאי הזרימה כפי שמוצג באיור 1. כל החלקים הללו ניתן לעשות שימוש חוזר בין הניסויים. <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. התא זרימה מערכת ההתקנה (מרכיבים חיוניים של ההתקנה). מערכת התא זרימה מורכב מספר מרכיבים: בקבוק בינוני, משאבה peristaltic, מלכודות בועה, התא זרימה, בקבוק פסולת, וחתכים שונים של צינורות מחוברים על ידי מחברים שונים. איור מספקים בנדיבותם על ידי רונה Lyngklip. 2. האסיפה של התא זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התא זרימה (איור 2 א) מטופל עם נתיבי דקה של דבק סיליקון, באמצעות מזרק (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים פיסת לכסות על גבי קווי סיליקון (איור 3). תלושי זכוכית לכסות משמשים תשתית עבור פ aeruginosa בעוד פתקי PVC לכסות מוחלים על S. cerevisiae biofilm. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. שרטוט סכמטי של התא זרימה מלכודת בועה 2. תיאור מפורט של ממדים המשמש לייצור של מלכודת) תא ב) בועה זרימה, ביולוגיה DTU מערכות. והודפס מחדש באישור וג&#39;ון וילי ובניו בע&quot;מ (DTU Systems Biology היה זכאי בעבר Biocentrum, כמתואר באיור) <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. איור של דבק סיליקון קווי הבקשה מצורף של תשתית הזכוכית. הזכוכית המכסה הצביעו מושם על הדבק סיליקון לצרף אותו התא זרימה. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התא זרימה מעל ולמקם אותו על משטח שטוח עם הצד לכסות להחליק למטה. לחצו בעדינות על גבו של התא זרימה לדחוף את תלוש לכסות על בסיס של התא זרימה. הפעל את התא זרימה מעל ולבדוק עבור אזורים שאינם חתומים על ידי הסיליקון. (בוכנה) ידית חלק מזרק יכול לשמש ככלי בעדינות ללחוץ על תא הזכוכית וזרימת יחד. </li></ol> 3. בקבוק בינוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח סיליקון צינור האכלה (2 מ&quot;מ קוטר פנימי) בבקבוק בינוני להוסיף מחבר ישר בקצה השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני עד הבקבוק (עבור תוכן בינוני לראות &quot;התקשורת&quot; פסקה) כיסוי מחבר בקבוק עם רדיד מתכת החיטוי הבינוני. ודא כי בסופו של צינור אספקה ​​קבועה מעל פני הנוזל בבקבוק בינוני או אפקט סיפון עשוי לרוקן את בקבוק בינוני כאשר מעוקר. </li></ol> 4. חיבור מלכודת הבועה, תזרים תא משאבה להרכיב את כל צינורות על פי המתווה באיור 1. השתמש בצינור סיליקון למעט החלק שעובר המשאבה peristaltic שם צינורות Marprene מוחל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחבר את הצינור מהבקבוק בינוני לכל חדרי תזרים בודדים, לפצל צינור למספר הנדרש של פתחי הכניסה מוחל בניסוי. השתמש ב-T-מחברים כדי להפוך את המספר הרצוי של צינורות חיבור בין צינור ההזנה של צינורות Marprene בתוך המשאבה (ראה איור 1, T-מחבר). זה בדרך כלל רעיון טוב כדי לשמור על הסדר אותו רצף של צינורות ותאי לזרום בכל המערכת, כדי להקל על זיהוי של רכיבים במקרה של תקלות במערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור כל צינור האכלה בודדים (2 מ&quot;מ קוטר) כדי Marprene צינורות המשאבה באמצעות מחברים ישר. חבר את צינורות Marprene ללכוד בועה (איור 2b) דרך צינור סיליקון ביניים (1 מ&quot;מ קוטר). ודא כי המשאבה מחוברת כניסת בחלק הגבוה של המלכודת בועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את צינור מוצא וכתוצאה מכך של מלכודות בועה אל מפרצון את זרימת התא (1 מ&quot;מ קוטר), לוודא כי אורך tubings אלה מאפשר התא זרימה להתרגש לשלב של המיקרוסקופ confocal (בדרך כלל 1 מ &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 5 מזרקים מ&quot;ל על גבי מלכודות בועה. סגור את צמרות עם כמוסות מתאימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מוצא התא זרימה חיבור קצר, כ 40 מ&quot;מ של חתיכה (1 מ&quot;מ קוטר), צינורות ולהשתמש &quot;צמצום&quot; מחבר ישר לצרף צינור פסולת (2 מ&quot;מ קוטר) באורך הדרוש. המקום צינורות פסולת במיכל הפסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב לציין, מיכל פסולת חייב תמיד להיות ממוקם באותה רמה כמו תאים הזרימה, מעולם מתחת לרמה תזרים תאים. כמו כן, ודא כי בסופו של צינורות הפסולת הוא קבוע מעל פני הצפוי של פסולת נוזלית כדי למנוע סומק גב עקב אפקט הסיפון בעת ​​טיפול בתאי לזרום. </li></ol> 5. חיטוי ושטיפת מערכת זרימת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מלכודת כמוסות בועה ולמקם אותם באתנול 70% כדי לשמור אותם סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלת המשאבה במהירות הגבוהה ביותר כדי למלא את המערכת עם 0.5% (V / V) hypochlorite נתרן במים. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את מלכודת כמוסות בועה בחזרה כאשר מלכודות בועה מלאים לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על תאים זרימת כדי להסיר בועות בחדר זרימה. הקפד לא לפגוע זכוכית לכסות שביר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר מערכת לעקר עבור 3-4 שעות בקצב הזרימה של 3 מ&quot;ל / שעה / ערוץ (0.2 מ&quot;מ / s קצב זרימה ליניארי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המערכת 2-3 פעמים כדי לשטוף את כל hypochlorite. מילוי לרוקן את המערכת עם מים סטריליים. מלכודות הבועה צריך להיות מרוקן לחלוטין בין כל לשטוף. ניתן לעשות זאת על ידי שאיבה באוויר עד מלכודות בועה כבר התרוקן. לאחר ריקון, להסיר כמוסות מן מלכודות בועה לפני מילוי המערכת. החלף כמוסות לאחר מלכודות בועה מולאו לחלוטין בנוזל. חזור כנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מים סטריליים באמצעות המערכת בקצב זרימה נמוכה (1-3 מ&quot;ל / שעה / ערוץ) במשך לילה או להמשיך לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את בקבוק בינוני עד כניסת ולשטוף את המערכת עם בינוני במשך הלילה בקצב זרימה נמוכה (3 מ&quot;ל / שעה / ערוץ) בטמפרטורה שבה הניסוי יבוצע. הערה: מלכודות בועה יש לרוקן את המים לפני מערכת מתמלא בינוני. </li></ol> 6. הרכבה של התא זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתוך התרבות לילה לעשות דילול צפיפות אופטית הרצוי (למשל עבור aeruginosa פ 0.001 OD 600nm ו - 0.1 OD 600nm עבור cerevisiae ס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במזרק 0.5 מ&quot;ל עם מחט 27G לטעון inoculum מספיק כדי למלא את החדר. 250 μL מספיק עבור לתאי תזרים בעל הממדים שצוינו בעבודה זו (איור 2., 40 מ&quot;מ x 4 מ&quot;מ x 1 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את המשאבה peristaltic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את צינורות סיליקון מובילים אל התא זרימה כדי למנוע חזרה לזרום לתוך המערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את האתר חיסון על צינורות סיליקון ידי מנגב אותו עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט לתוך הצינור סיליקון להציג את קצה לתוך מפרצון של התא זרימה. לאט לאט להזריק את inoculum החדרה (להיזהר לא להזריק בועות אוויר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המחט למחוק את האתר עם הזרקת אתנול 70% ואחריו אטימה מיידית של החור באמצעות דבק סיליקון על הזריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את התא זרימה ולתת מיקרו אורגניזמים לדבוק לתשתית במשך שעה 1 ללא לזרום דרך התא זרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התא זרימה, להפעיל את המשאבה בינוני (3 מ&quot;ל / שעה / ערוץ) ולקחת את מהדק את שפופרת סיליקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המערכת ממוקמת על הדגירה, בשעה 37 ° C במקרה של פ aeruginosa ו - 30 ° C במקרה של ס cerevisiae. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Biofilm בתאי תזרים כעת ניתן דמיינו ידי CLSM. </li></ol> 7. הכתמה של biofilm עבור מיקרוסקופיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע דילול מכתים המתאים (למשל 1:1000 Syto 9 לחיות כתם על cerevisiae ס) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את המשאבה peristaltic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלאמפ של צינורות סיליקון המוביל התא זרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר אתר חיסון על צינורות סיליקון ידי מנגב אותו עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במזרק 0.5 מ&quot;ל עם מחט 27G לטעון פתרון מכתים מספיק כדי למלא את החדר. 250 μL מספיק עבור לתאי תזרים משמש כאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט לתוך הצינור סיליקון להציג את קצה לתוך מפרצון של התא זרימה. לאט לאט להזריק את הפתרון מכתים החדרה (להיזהר לא להזריק בועות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המחט למחוק את האתר עם הזרקת אתנול 70% ואחריו איטום המיידית של הזריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את התא זרימה ללא זרימה במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוריד את מהדק ולהתחיל את הזרימה (3 מ&quot;ל / שעה / ערוץ) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת את הנתונים עם CLSM </li></ol>

<ol>
	<li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms:+a+common+cause+of+persistent+infections.">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li><li>Sternberg, C., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+and+analyzing+biofilms+in+flow+cells.">Growing and analyzing biofilms in flow cells.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 1, 2-2 (2006).</li><li>Heydorn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+reproducibility+in+flow-chamber+biofilms.">Experimental reproducibility in flow-chamber biofilms.</a> Microbiology. 146, 2409-2415 (2000).</li><li>Pamp, S. J., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+biosurfactants+in+structural+biofilm+development+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Multiple roles of biosurfactants in structural biofilm development by Pseudomonas aeruginosa.</a> J Bacteriol. 189, 2531-2539 (2007).</li><li>Haagensen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+distribution+of+colistin-+and+sodium+dodecyl+sulfate-tolerant+cells+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Differentiation and distribution of colistin- and sodium dodecyl sulfate-tolerant cells in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> J Bacteriol. 189, 28-37 (2007).</li><li>Klausen, M., Aaes-Jorgensen, A., Molin, S., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+bacterial+migration+in+the+development+of+complex+multicellular+structures+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Involvement of bacterial migration in the development of complex multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Mol Microbiol. 50, 61-68 (2003).</li><li>Pamp, S. J., Gjermansen, M., Johansen, H. K., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+to+the+antimicrobial+peptide+colistin+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+is+linked+to+metabolically+active+cells,+and+depends+on+the+pmr+and+mexAB-oprM+genes.">Tolerance to the antimicrobial peptide colistin in Pseudomonas aeruginosa biofilms is linked to metabolically active cells, and depends on the pmr and mexAB-oprM genes.</a> Mol Microbiol. 68, 223-240 (2008).</li><li>Pamp, S. J., Sternberg, C., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+microbial+multicellular+lifestyle+via+flow-cell+technology+and+confocal+microscopy.">Insight into the microbial multicellular lifestyle via flow-cell technology and confocal microscopy.</a> Cytometry Part A. 75A, 90-103 (2009).</li><li>Barken, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+type+IV+pili,+flagellum-mediated+motility+and+extracellular+DNA+in+the+formation+of+mature+multicellular+structures+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Roles of type IV pili, flagellum-mediated motility and extracellular DNA in the formation of mature multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Environ Microbiol. 10, 2331-2343 (2008).</li><li>Qin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+autolysin-mediated+DNA+release+in+biofilm+formation+of+Staphylococcus+epidermidis.">Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis.</a> Microbiology. 153, 2083-2092 (2007).</li><li>Allesen-Holm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+characterization+of+DNA+release+in+Pseudomonas+aeruginosa+cultures+and+biofilms.">A characterization of DNA release in Pseudomonas aeruginosa cultures and biofilms.</a> Mol Microbiol. 59, 1114-1128 (2006).</li><li>Heydorn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT.">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).</li><li>Palmer, R. J., Haagensen, J. A., Neu, T. R., Sternberg, C., Palmer, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 882-900 (2006).</li><li>Haagensen, J. A., Regenberg, B., Sternberg, C., M&#252;ller, S., Bley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> High Resolution Microbial Single Cell Analytics Advances in Biochemical Engineering and Biotechnology. , (2010).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אנחנו הוכיחו תא זרימה מערכת המייצגת כלי רב עוצמה בחקירות biofilm. בשילוב עם הדמיה 3D ידי מיקרוסקופיה confocal, המערכת מציעה מגוון יתרונות בהשוואה לשיטות אחרות של ניתוח biofilms חיידקים באמצעות שיטות מיקרוסקופיות מסורתיים יותר. מערכת זו מאפשרת הדמיית 3D של חיים מיקרוביאליים קהילות biofilm ללא הפרעה של הקהילה. במיקרוסקופ אור לא תספק מידע מפורט על נישות של biofilm ובעוד במיקרוסקופ אלקטרונים מספקת רזולוציה ננומטרי של biofilm, הוא אינו מאפשר הדמיה תא חי. באמצעות ערוץ המתואר זרימת מערכת הובהר לנו בעבר את הפריסה המרחבית של תאים חיידקיים רגיש לאנטיביוטיקה מספר 5-8 (איור 4 א), הפצה של חומרים תאיים, למשל DNA ו 9-11, חלוקת תאים ניעתי ולא ניעתי של מאותו המין בתוך קהילה חיידקי 4,6,9 (איור 4 ג&#39;). אנו צופים כי המערכת התא זרימה ניתן ללמוד היבטים של biofilms שמרים. זה עשוי להיות הפצה spatio הזמני של biofilm שמרים בתגובה גורמים סביבתיים כמו קוטלי פטריות, וכן זיהוי של גנים המעורבים בהתפתחות biofilm שמרים. למרות שמרים לא ידוע להתמיין לתאי ניעתי ולא ניעתי, היבטים אחרים של גיוון עשוי להיות biofilm מחקרים כגון השינוי המורפולוגי של שמרים לתאי pseudohyphal ואת המעבר הפלואידים לתאי דיפלואידי. הראינו מערכת לציית מינים של חיידקים כמה יעבוד עם טכניקות צביעה שונות. מגוון בדיקות מכתים שונים חלבוני ניאון, כגון ה-GFP, לאפשר חקירות נישה ספציפיים biofilm המתפתח והוא מהווה כלי יעיל בניתוח ההשפעה של סוכני מיקרוביאלית או גורמים סביבתיים אחרים. המידע ניתן להשיג מפורט מאוד (איור 4) ותכונות biofilm ניתן לכמת עם תוכנות מחשב כגון סטטמ&quot;מ 12,13. בסך הכל, ההיבט הקריטי ביותר של פרוטוקול היא העובדה כי זהו תהליך גוזל זמן. זה גם מגבלה כי התאים צריכים להיות מסוגלים לגדול על משטח שאינו פלורסנט שקוף. . מכיוון biofilm נוצר מנותח באמצעות מיקרוסקופ confocal, עומק שניתן לחקור מוגבלת מאה מיקרומטר מספר 14 יש עוד מגבלות טכניות הטמון בעיצוב: המערכת אינו מתאים להקרנה תפוקה גבוהה, כחוקר מנוסה יכול לטפל בכ 15 ערוצי ביותר בכל ניסוי, אשר בתורו יכול לקחת כמה ימים כדי להתכונן. עם זאת, אנטיביוטיקה או מוטציות שנחשבים רלוונטיים ללימודי biofilm יכולים בתחילה להיות מסה הוקרן עם שיטות אחרות כגון מכתים סגול גביש לפני המועמדים המעניינים ביותר מועברים למערכת התא זרימה. יריעות כיסוי זכוכית דקים מאוד לשבור בקלות, יש להיזהר בעת הטיפול במערכות. בנוסף צינורות יש לבחון מדי יום במהלך הריצה של ניסוי, כמו רב &quot;גב צמיחה&quot; של צינורות כניסת רק נגד הזרם של תאים זרימת יכול להתרחש. זיהום מסוג זה ניתן לפתור על ידי הסרת כמה סנטימטרים של צינור סיליקון מהצד מפרצון של תאים הזרימה, באמצעות טכניקה סטרילית. <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4 PAO1 הישן) יום 4 -. Biofilm GFP שטופלו במשך 24 שעות עם Colistin ו יודיד Propidium עבור מכתים מת (כתם אדום) ב) מצגת 3D של יום שלוש פ &#39;הישן aeruginosa PAO1 (סוג P. aeruginosa בר) - GFP biofilm 6 ג) 3D מצגת תמונה של PAO1 - CFP Pila מוטציה (כחול) עם PAO1 סוג YFP בר (צהוב) ד) 5, יום PAO1 בן - GFP biofilm כפי שהוצגו 3D דואר תמונה) 26 ש &#39;ח (PTR3 מוטנטי CEN.PK רקע) biofilm cerevisiae מוכתם Syto-9 15.

<ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבועה מלכודות, פוליאתילן (DTU Systems Biology, האוניברסיטה הטכנית של דנמרק, http://www.csm.bio.dtu.dk/Instrument 20Center/Resources/Biofilm% 20Setup.aspx%) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה פלסטיק פוליפרופילן המחברים ו-T-מחברים (קול לבן הזוג, 1 / 8 אינץ&#39; (3.175 מ&quot;מ) 1 / 16 אינץ&#39; (1.588 מ&quot;מ)) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Clamps </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Confocal מיקרוסקופ (Zeiss, Meta LSM510) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslips, זכוכית (Knittel גלזר) 50 x 24 מ&quot;מ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslips, PVC coverslips (Rinzl) 50 x 24 מ&quot;מ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תזרים תאים, פוליאתילן (DTU Systems Biology, האוניברסיטה הטכנית של דנמרק, http://www.csm.bio.dtu.dk/Instrument 20Center/Resources/Biofilm% 20Setup.aspx% </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבוקי בינוני (שוט) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Peristaltic משאבה (ווטסון, מרלו, 205S) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רולינג עגלה עבור מערכות זרימה ומשאבות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דבק סיליקון (3M איטום סופר סיליקון שקוף) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרק 5 מ&quot;ל (Terumo) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Syto 9 (בדיקות מולקולריות) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרקים 0.5 מ&quot;ל עם מחטים (27G, Terumo LU-100) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיכל פסולת </li></ul> Tubing: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיליקון, 3 מ&quot;מ קוטר חיצוני, 1 מ&quot;מ קוטר פנימי (אולה דיך) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיליקון, 4 מ&quot;מ קוטר חיצוני, קוטר פנימי 2 מ&quot;מ (אולה דיך) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Marprene, בקוטר של 3 מ&quot;מ החיצוני, 1 מ&quot;מ קוטר פנימי (ווטסון, מרלו) </li></ul> מדיה <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> P. aeruginosa בינוני </td></tr><tr><td> A10 </td><td> g / L </td></tr><tr><td> (NH 4) 2 SO4 </td><td> 2.0 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 X 2H 2 O </td><td> 6.0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 3.0 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 3.0 </td></tr><tr><td> דוד לחץ </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td></tr><tr><td colspan="2"> פנסיון מלא </td></tr><tr><td> MgCl 2 6 שעות 2 O </td><td> 0.20 </td></tr><tr><td> 1 מ&quot;ל 1 M CaCl 2 </td><td> 0.01 </td></tr><tr><td colspan="2"> 100 μL / L עקבות מתכות (עבור P. aeruginosa-biofilms) 4 </td></tr><tr><td colspan="2"> דוד לחץ </td></tr><tr><td colspan="2"> מערבבים A10 ו FB על יחס של 1:10. </td></tr><tr><td colspan="2"> הוסף מקור פחמן בריכוז הרצוי. </td></tr></tbody></table> <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> ס סינתטי cerevisiae בינוני מלא (SC) </td></tr><tr><td></td><td> g / L </td></tr><tr><td> אדנין סולפט </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L-טריפטופן </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L-היסטידין-HCL </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L-ארגנין-HCL </td><td> 0.04 </td></tr><tr><td> L-מתיונין </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L-tyrosine </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> L-לאוצין </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> L-isoleucine </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> L-ליזין-HCL </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> L-פנילאלנין </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> L-חומצה אספרטית </td><td> 0.10 </td></tr><tr><td> L-חומצה גלוטמית </td><td> 0.10 </td></tr><tr><td> L-valine </td><td> 0.15 </td></tr><tr><td> L-תראונין </td><td> 0.20 </td></tr><tr><td> L-סרין </td><td> 0.40 </td></tr><tr><td> שמרים ניטרוגן בסיס w / o חומצות אמינו אמוניום (Bacto) </td><td> 1.6 </td></tr><tr><td> אמוניום סולפט </td><td> 5.0 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> 6.0 </td></tr><tr><td> Succinic חומצה </td><td> 10.0 </td></tr><tr><td> דוד לחץ </td><td></td></tr><tr><td> גלוקוז (autoclaved בנפרד) </td><td> 0.20 </td></tr></tbody></table>

pseudomonas aeruginosa and saccharomyces cerevisiae biofilm in flow cells

תאים של חיידקים רבים יש את היכולת ליצור קהילות מיקרוביאלי נייחים כהגדרתו biofilms כי שינו תכונות פיזיולוגיות פתולוגי לעומת מיקרואורגניזמים שחיים חינם. Biofilms בטבע הם לעתים קרובות קשה לחקור מתגוררים תחת תנאים מוגדרים היטב 1. באמצעות תשתית שקוף זה אפשרי למכשיר מערכת שבה biofilms פשוטה ניתן לבדוק באופן בלתי הרסניות בזמן אמת: כאן אנו מדגימים את הרכבה והפעלה של מערכת התא זרימה מודל, עבור במבחנה 3D של biofilms חיידקים יצירת reproducibility גבוהה תחת תנאים מוגדרים היטב 2,3. המערכת כוללת תא זרימה המשמש חדר הצמיחה biofilm. התא זרימה מסופק עם חומרי מזון וחמצן מן הבקבוק בינוני באמצעות משאבה peristaltic ובינוניים בילה נאסף במיכל אשפה. זה בנייה של מערכת הזרימה מאפשר אספקה ​​רציפה של חומרים מזינים מתן אנטיביוטיקה למשל עם הפרעה מינימלית של תאים בוגרים בחדר זרימה. יתר על כן, תנאי הזרימה בתוך התא זרימה לאפשר מחקרים biofilm שנחשפו ללחץ גזירה. בועה השמנה גבולות מכשיר בועות אוויר מן הצינור, אשר אחרת עלולה לשבש את המבנה biofilm בתוך התא זרימה. מערכת התא זרימה תואמת מיקרוסקופית סריקה Confocal לייזר (CLSM) והוא יכול ובכך לספק מידע 3D מפורט ביותר על פיתוח biofilms חיידקים. תאים biofilm יכול להיות מתויג עם בדיקות ניאון או חלבונים בקנה אחד עם ניתוח CLSM. זה מאפשר הדמיה מקוונת המאפשרת חקירת נישות biofilm המתפתח. הגומלין מיקרוביאלית, חקירת סוכני מיקרוביאלית או את הביטוי של גנים ספציפיים, הם של ניסויים רבים setups שניתן לחקור במערכת התא זרימה.

Watch this Scientific Journal Video about Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells at JoVE.com

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

הפרוטוקול מתאר את היישום של מערכת התא זרימה לגידול וניתוח biofilms חיידקים מיקרוסקופית סריקה Confocal לייזר (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa ו biofilm Saccharomyces cerevisiae בתוך תאים Flow

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-מודלים של תרבות Pseudomonas aeruginosa Biofilms גדל על תאים חיים Airway האדם

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA בידוד Pseudomonas aeruginosa מיישבים את מערכת העיכול Murine

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; בתנאי רלוונטיים יותר ריאות סיסטיק פיברוזיס

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

כרוני לטווח ארוך<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; זיהום דרכי הנשימה בעכברים

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

זיהוי גנים הקשורים לרומן אלגינט ייצור ב<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; שימוש מיני<em&gt; Himar1</em&gt; Mutagenesis תיווך transposon מרינר

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa מושרה ריאות פגיעה דגם

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

לצידו. אור: בויוו ניטור של דלקות Biofilm Pseudomonas aeruginosa לפצעים כרוניים במודל מאתר של שיער סוכרתית

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

שכפול של הוזמן, ספריית Nonredundant של Pseudomonas aeruginosa זן PA14 Transposon ההכנסה מוטציות

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

שיטות זיהוי ציטוטוקסיות Amyloids הבאים זיהום של אנדותל תאי הריאות על ידי Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

תרבות של וריאציה של המושבה הקטנה של הפסאודומונס וככמת של האלגיאט

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...