Name: cryopreservation of cortical tissue blocks for the generation of highly enriched neuronal cultures
Uploaded: 2010-11-11T18:00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures at JoVE.com

Denna forskning har finansierats med bidrag från Grundutbildning forskningsmöjligheter Program vid UCI (AR och SP) och bidrag från delstaten Kalifornien Alzheimers sjukdom Initiative och National Institutes of Health bidrag nr. HD38466 och Alzheimers Disease Research Center bidrag nr. AG16573 (JB)

1. Frysförvaring av kortikal vävnad Blocks Material Förberedelser <ol><li> Bered 1x Hanks buffrad saltlösning (HBSS) genom att späda på 10X stamlösning i sterilt vatten (1:09). Förvara HBSS vid 4 grader Celsius. </li><li> Förbered 10% DMSO frysning medelstora genom att späda DMSO i HBSS (1:09). Frysning medium bör göras färsk innan frysförvaring och förvaras vid 4 grader Celsius fram till kyld. </li><li> En stål rakblad används för systematisk hugga av vävnad. Innan användning, rakbladet steriliseras genom nedsänkning i 70% etanol i 2 tim. Omedelbart före vävnad bearbetning, skölj rakbladet med sterilt vatten 3 gånger. Undvik att lämna rakkniv i sterilt vatten för en alltför lång tid, eftersom det är utsatt för oxidation. </li><li> En Nalgene frysning container är lastad med cryovials (2,5 ml) och sedan förs in i en steril biologiska skåp. 1 mL kylda frysning mediet läggs till varje flaska. Frysning behållaren placeras sedan vid 4 grader Celsius i minst 2 timmar. </li></ol> Rengöring, Hacka, och frysning <ol><li> Hjärnvävnaden som skall frysas städas av meningeal membran och blodkärl. Använd steril nål tips för att försiktigt ta bort skräp från vävnaden samtidigt som du arbetar på toppen av en kylpåse. Rengjord vävnad bör sköljas försiktigt med kallt HBSS och överföras till en ny petriskål för att hacka. </li><li> Att arbeta på toppen av en ispåse, använd ett steriliserat rakblad för att snabbt hacka vävnaden till ca 1 mm 3 kvarter. Arbeta med små portioner av rengjorda vävnaden vid en tidpunkt leder till bättre kontroll över hugga förfarande, vilket resulterar i jämnare blockstorlekar. </li><li> Tillsätt långsamt hackad vävnad till 50 mL HBSS i en 50 ml koniska rör. Försiktigt skölja petriskål med HBSS för att samla in eventuella kvarvarande vävnad block. Låt vävnaden block för att gå ner till botten av röret, vilket skapar en löst packad vävnad blocket pellets. </li><li> Medan vävnaden är lösa, ta med den tidigare kylda frysning behållare och cryovials i biologisk säkerhet skåp. Ta bort skyddet alla cryovials att påskynda processen att lägga vävnad. </li><li> Efter alla vävnaden block har slagit sig försiktigt aspirera överskottet HBSS och lämnar ett mycket tunt lager av media över pelleten. Centrifugering motverkas eftersom det kommer leda till att vävnaden block för att hålla sig till varandra, vilket avsevärt minskar frysning effektivitet. </li><li> Sakta samlar 200 mikroliter från botten av den lösa vävnaden blocket pellets med hjälp av pipettspetsen med breda öppningar (klipp spets med steril sax). Överför materialet till en cryovial och gå vidare till nästa, återigen samla vävnad från botten av pellets. Det är viktigt att hela vävnaden tilldelningsförfarandet inte ta mer än 3-4 minuter per frysning container. Detta säkerställer att vävnaden utsätts för DMSO endast en kort tid före frysning. Efter överföring av vävnaden till rören, placera frysning behållaren i en--80 ° C frys i minst 4 timmar. Alternativt kan frysa behållaren lämnas över natten vid -80 oC. Upprepa denna process för eventuella återstående frysning behållare. </li><li> Överför cryovials från frysning container (s) till ett cryobox och placera i en flytande kväve tank för långtidsförvaring. </li></ol> 2. Upptining och odling av Frozen kortikala Tissue Blocks Material Förberedelser <ol><li> En dag före upptining vävnadsprover, poly-L-lysin belagd petriskålar / täckglas är beredda. I allmänhet för kortikala neuroner vi förbereda belagda rätter med 500 mikrogram / ml eller 1 mg / ml. Lägg tillräckligt med poly-L-lysin lösning (som görs i boratbuffert) för att helt täcka botten av skålen. Om glaset täckglas krävs, se till att de är helt under vatten under poly-L-lysin lösning. Inkubera i minst 12 tim. Före användning, skölj disken med en liberal mängd sterilt vatten 3 gånger, 5 min vardera. </li><li> Varm HBSS används för att rengöra tinas vävnad samt att skilja vävnaden i cellsuspensioner. Volymen som behövs HBSS kommer att variera beroende på hur mycket vävnad som ska tinas, men vanligtvis 1 cryovial kommer att späda i 50 ml HBSS och kommer att skilja i 10 ml HBSS. </li><li> Dulbecco ändrade Eagle Medium med 10% järn kompletteras bovint kalvserum (EBS) och 1% antibiotika / antimykotika (AA) blandning (DMEM (++)) ska placeras i en 37 ° C vattenbad. </li><li> Plätering medium (bör NB (+++)) göras färska före användning. Detta medium är förberett genom att lägga till 1% antibiotika / antimykotika plus B27 och kosttillskott N2. </li></ol> Obs: Media namn bifogas med kors (+) indikerar att införa tillsatser till basen sammansättningen av media. I denna text, DMEM (+ +) betecknar DMEM plus 10% EBS plus 1% AA, medan NB (+++) betecknar NB ploss 1% AA plus B27 plus N2. Upptining och Odling <ol><li> Ta bort cryovials från flytande kväve tanken och snabbt tina i 37 ° C i ett vattenbad tills bara en liten is pellets observeras inne i flaskan innehåll. </li><li> Försiktigt överföra flaskan innehåll till 50mL av varma HBSS i en konisk tub. Använd en bred öppning tips till försiktigt loss eventuella kvarvarande vävnad block fastnat i cryovial. Vänd röret 3-4 gånger och låt vävnaden sakta samla på botten. Tissue bör lösa snabbt, men om blocken är för små så inte kan ske och lätt centrifugering (~ 200 x g) rekommenderas. </li><li> Aspirera överskott HBSS. </li><li> Tillsätt 10 ml varmt HBSS till vävnaden pelleten och 300 mikroliter av 0,25% trypsin och 50 mikroliter av DNAase. Inkubera i 37 ° C vattenbad i 5 min, sedan plats i en skakapparat inställd på 80 rpm och 37 ° C i ytterligare 5 min. </li><li> Efter denna period föra vävnaden block ner en biologisk säkerhet skåp och använda en 10 ml pipett att noga agitera vävnaden blocken tills en grumlig cellsuspension bildas. Avaktivera trypsin genom att tillsätta 10 ml varmt DMEM (+ +) till cellsuspension. </li><li> Centrifugera dissocierade celler vid 1200 x g i 5 minuter. Aspirera och kassera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 10 ml varmt DMEM (+ +) och kvantifiera mobilnummer med hjälp av en hemocytometer. </li><li> Tavla celler poly-L-lysin belagda rätter. Vanligtvis kommer ett 60-mm maträtt beläggas med 1x10 6 celler. </li><li> Låt cellerna att fästa skålen / täckglas i ca 1 timme i vävnadsodling inkubatorn. Det rekommenderas att övervaka utvecklingen av bilagan i en tallrik var 10 min tills effektiv fastsättning observeras. Sedan försiktigt ersätta mediet med färska DMEM (++). </li><li> Efter 24 timmar, byt DMEM (+ +) med varmt NB (+++). Partiell medelstora förändringar (50%) görs varje 5 dagar med färska NB (+++). Friska kulturer brukar visa tecken på differentiering och tillväxt av processer efter 24 timmar. Under dessa förhållanden, och utföra partiella medelstora förändringar varje 4-5 dagar, kan de kulturer upprätthållas under längre perioder på upp till 4-6 veckor. </li><li> För generering av neuronala föregångare celler (NPC), är ett liknande protokoll som används med undantag för att efter centrifugering är DMEM utan EBS används. Celler är pläterade i T-25 kolvarna i DMEM/F12 (1:3) kompletterat med B27 och EGF (20 ng / ml) för att möjliggöra bildandet av neuropheres. För att skilja NPC: er, är neurospheres pläterade på laminin (10 ug / ml) bestruket täckglas i DMEM/F12 (1:3) mediet kompletteras med N2. </li></ol> 3. Representativa resultat Friska kulturer kommer att visa betydande tillväxt och differentiering efter 5 dagar efter upptining och kommer vanligtvis att stabiliseras under sin tillväxt med 10 dagar (Figur 1). Immuncocytochemical färgning av dessa kulturer avslöjar många astrocyter (Figur 2A) och neuron (figur 2B) för både människa och råtta primära neuronala kulturer. Detta protokoll är också lämplig för generering av NPC: er som fritt flytande neurospheres (Figur 3A), som enligt skilja förhållanden resulterar i hög kvalitet blandade kulturer (Figur 3B, C). <img src="/files/ftp_upload/2384/2384fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Cellkulturer av frysta mänskliga kortikal vävnad. Frysta mänskliga kortikal vävnad block tinas och pläterade på poly-lysin belagda täckglas och odlas i 10 dagar. Vid dag 5 cell expansion är uppenbar och dag 10 confluency uppnås. Skala bar: 100 ìm. <img src="/files/ftp_upload/2384/2384fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. Immuncytokemiska färgning av cellkulturer. (A) kulturer färgades med gliaceller markör gliaceller fibrillära surt protein (GFAP, tjocka pilar). (B) Nervceller upptäcktes med neuronala markör beta-tubulin III (TIII, tunna pilar). (C) Både människor och kulturer råtta visar riklig Glia och nervceller efter 10 dagar i kulturen. Primära antikroppar: mus-anti-GFAP (1:1000) och kanin anti-TIII (1:1000). Sekundära antikroppar: anti-mus Alexa 594 (1:500) och anti-kanin Alexa 488 (1:500). Nuclei färgning: Hoestch blå (1:1000). Skala bar: 50 ìm. <img src="/files/ftp_upload/2384/2384fig3.jpg" alt="Figur 3" /> Figur 3. Generering av neurospheres. (A) Fryst vävnad bearbetades enligt ovan och får möjlighet att sprida så neurospheres. (B) Neurospheres var klädd på glas täckglas i differentiera förhållanden och som odlas för 10 dagar, vilket resulterar i celler flyttar bort från neurosphere. (C) både nervceller och astrocyter finns i den växande utkanten av en differentiering neurosphere. Nuclear motfärgning, primära och sekundära antikroppar använts som i figur 2.

<ol>
	<li>Robbins, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+human+brain+tissue.">Cryopreservation of human brain tissue.</a> Exp Neurol. 107, 208-213 (1990).</li><li>Ware, C. B., Nelson, A. M., Blau, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled-rate+freezing+of+human+ES+cells.">Controlled-rate freezing of human ES cells.</a> Biotechniques. 38, 879-880 (2005).</li><li>Paynter, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+practical+issues+for+cryopreservation+of+nerve+cells.">Principles and practical issues for cryopreservation of nerve cells.</a> Brain Res Bull. 75, 1-14 (2008).</li><li>Thirumala, S., Gimble, J. M., Devireddy, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+stromal+vascular+fraction+of+adipose+tissue+in+a+serum-free+freezing+medium.">Cryopreservation of stromal vascular fraction of adipose tissue in a serum-free freezing medium.</a> J Tissue Eng Regen Med. 4, 224-232 (2010).</li></ol>

Frysförvaring erbjuder en möjlighet att banken dyrbara prover hjärnvävnad för framtida bruk. Här beskriver vi ett enkelt men effektivt protokoll för att generera både neuron-berikade kulturer och neuronala celler föregångare från frysta block hjärnvävnad. Denna ekonomiska förfarande undviks kostnader för traditionella frysförvaring tekniker som utnyttjar dyrare takt kontrollerade frysar. Protokollet gör det möjligt för generering av livskraftiga neuronala kulturer efter upptining genom att ge en snabb men ändå effektivt sätt att frysa vävnaden block. Hela frysa processen kan ta så lite som 20 minuter. Utöver primära neuronala kulturer, kan använda denna block metod vävnad också tinas att generera NPC odlas som flytande neurospheres. I detta avseende ser avsaknaden av serum i vår frys medium som cellerna finns bevarade i en odifferentierad stat. Under skilja förhållanden, produceras neurospheres från fryst vävnad visa expansion och priser differentiering helt jämförbar med neurospheres genereras av färsk vävnad.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11995-073</td>
<td>High gluclose 1X</td>
</tr>
<tr>
<td>Bovine calf serum supplemented</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HYCLONE</td>
<td>SH30072.03</td>
<td>For culture medium </td>
</tr>
<tr>
<td>Neurobasal-A Medium (1X), liquid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>1088-022</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B27 Supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>Supplement for Neurobasal medium</td>
</tr>
<tr>
<td>N2 Supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17502-048</td>
<td>Supplement for Neurobasal medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypsin (10X)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro </td>
<td>25-054CI </td>
<td>Tissue dissociation</td>
</tr>
<tr>
<td>Deoxyribonuclease 1 from bovine pancreas (DNase)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D4527-30KU</td>
<td>Tissue dissociation</td>
</tr>
<tr>
<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (10X)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>14065</td>
<td>Cleaning tissue, washes, and freezing medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-L-Lysine- 500mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P2636</td>
<td>Substrate for adhesion of neuronal cells</td>
</tr>
<tr>
<td>antibiotic-antimycotic (100X), liquid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15240-062</td>
<td>To prevent contamination</td>
</tr>
<tr>
<td>Large orifice pipette Tips (1-200 ul)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fischer Scientific</td>
<td>02-681-141</td>
<td>To prevent shear stress to cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Graduated pipette tips (101-1000 ul)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>1111-2721</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>21 G1 precision guide needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckton Dickinson</td>
<td>305165</td>
<td>To clean tissue</td>
</tr>
<tr>
<td>10 ml pipette </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>1071-0810</td>
<td>Individually wrapped</td>
</tr>
<tr>
<td>50 ml tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>926-9-04</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Single edge razor blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Smith Brand</td>
<td>67-0238</td>
<td>To chop tissue</td>
</tr>
<tr>
<td>60 x 15 mm polystyrene petri dish </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>8609-0160</td>
<td>For general culture</td>
</tr>
<tr>
<td>100 x 15 mm polystyrene petri dish </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>8609-0010</td>
<td>For cleaning tissue</td>
</tr>
<tr>
<td>Cryogenic box </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NALGENE Labware</td>
<td>5026-1010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Freezing container</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NALGENE Labware</td>
<td>5100-0001</td>
<td>"Mr. Frosty"</td>
</tr>
<tr>
<td>2.0 ml cryogenic vials</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NALGENE Labware</td>
<td>5012-0020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMSO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fischer Scientific</td>
<td>D128-500</td>
<td>For freezing medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Ethanol 200 proof</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E7023</td>
<td>For sterilizing razor blade</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

cryopreservation of cortical tissue blocks for the generation of highly enriched neuronal cultures

I denna studie beskriva vi ett standardiserat protokoll för det framgångsrika frysförvaring och upptining av kortikala block hjärnvävnad att generera höganrikat neuronala kulturer. För detta protokoll frysning medium som används är 10% dimetylsulfoxid (DMSO) utspädd i Hanks buffrad saltlösning (HBSS). Block av kortikal vävnad överförs till cryovials innehåller frysning medium och långsamt frysas vid -1 ° C / min i en takt kontrollerad frysning behållare. Post-tina bearbetning och dissociation av frysta vävnads block konsekvent producerade neuronala-berikade kulturer som visade snabb neuritic tillväxt under de första fem dagarna i kultur och betydande utvidgning av det neuronala nätverket inom 10 dagar. Immuncytokemiska färgning med astrocytic markör gliaceller fibrillära surt protein (GFAP) och neuronala markör beta-tubulin klass III, visade ett stort antal nervceller och astrocyter i de kulturer. Generering av neurala kulturer föregångare cellen efter vävnaden blockera dissociation resulterat i snabbt växande neurospheres, som producerade ett stort antal nervceller och astrocyter i differentierande förhållanden. Denna enkla frysförvaring protokollet möjliggör för en snabb, effektiv och billig bevarande av kortikal block hjärnvävnad, vilket ger ökad flexibilitet för senare generation av neuronala, astrocyternas och neuronala kulturer föregångare cell.

Watch this Scientific Journal Video about Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures at JoVE.com

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

Här beskriver vi en metod för effektiv frysförvaring och upptining av kortikala block hjärnvävnad att generera höganrikat neuronala kulturer. Denna enkla protokoll ger flexibilitet för senare generation av neuronala, astrocyternas och neuronala kulturer föregångare cell.

Frysförvaring av kortikal vävnad block för generering av höganrikat Neuronal kulturer

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Generering av neuronala stamceller från kasserade mänskliga foster Bark-Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

Multi-elektrod Array Inspelningar av neuronala laviner i Organotypic kulturer

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Härledning av anrikat Oligodendrocyte kulturer och Oligodendrocyte / Neuron Myelinating Co-kulturer från Postnatal Murine vävnader

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

A Fully Automated and Highly Versatile System for Testing Multi-cognitive Functions and Recording Neuronal Activities in Rodents

En helt automatiserad och Mycket mångsidig system för att testa flera kognitiva funktioner och spela in neurala Aktiviteter i Gnagare

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be ...

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Beredning av Neuronal Co-kulturer med Single Cell Precision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Förlängd inkubation av akut neuronal vävnad för elektrofysiologi och kalcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Tidsberoende ökning av nätverkssvaret till stimulering av neuronala cellkulturer på mikroelektroder

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells

GM-fri generation av blodbaserade neuronala celler

Many human&#160;neurological disorders are caused by degeneration of neurons and glial cells in the brain. Due to limitations in pharmacological and other ...

Cone-Enriched Cultures from the Retina of Chicken Embryos to Study Rod to Cone Cellular Interactions

Konberikade kulturer från näthinnan av kycklingembryon för att studera stång till kon cellulära interaktioner

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form ...

Robust and Highly Reproducible Generation of Cortical Brain Organoids for Modelling Brain Neuronal Senescence In Vitro

Robust and Highly Reproducible Generation of Cortical Brain Organoids for Modelling Brain Neuronal Senescence In Vitro

Robust och mycket reproducerbar generation av kortikala hjärnorganoider för modellering av hjärnans neuronala åldrande in vitro

Brain organoids are three-dimensional models of the developing human brain and provide a compelling, cutting-edge platform for disease modeling and ...