Name: analysis of mrna nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection
Uploaded: 2010-12-04T13:00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection at JoVE.com

نود أن نشكر غوميز E. للحصول على المشورة المفيدة وايلد ألف لسماحه لنا باستخدام معدات مختلفة. وأيد هذا العمل من خلال منحة لوكالة فرانس برس من المعهد الكندي للبحوث الصحية (سندات السعر العائم 102725).

<ol>
	<li>Luo, M. J., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+is+required+for+rapid+and+efficient+mRNA+export+in+metazoans.">Splicing is required for rapid and efficient mRNA export in metazoans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 14937-14942 (1999).</li><li>Bossie, M. A., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+of+macromolecules+between+the+cytoplasm+and+the+nucleus+in+yeast.">Movement of macromolecules between the cytoplasm and the nucleus in yeast.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 2, 768-774 (1992).</li><li>Farny, N. G., Hurt, J. A., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+global+and+transcript-specific+mRNA+export+pathways+in+metazoans.">Definition of global and transcript-specific mRNA export pathways in metazoans.</a> Genes Dev. 22, 66-78 (2008).</li><li>Audibert, A., Weil, D., Dautry, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+kinetics+of+mRNA+splicing+and+transport+in+mammalian+cells.">In vivo kinetics of mRNA splicing and transport in mammalian cells.</a> Mol. Cell. Biol. 22, 6706-6718 (2002).</li><li>Snaar, S. P., Verdijk, P., Tanke, H. J., Dirks, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+HCMV+immediate+early+mRNA+expression+in+stably+transfected+fibroblasts.">Kinetics of HCMV immediate early mRNA expression in stably transfected fibroblasts.</a> J. Cell. Sci. 115, 321-328 (2002).</li><li>Palazzo, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+signal+sequence+coding+region+promotes+nuclear+export+of+mRNA.">The signal sequence coding region promotes nuclear export of mRNA.</a> PLoS Biol. 5, e322-e322 (2007).</li><li>Valencia, P., Dias, A. P., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+promotes+rapid+and+efficient+mRNA+export+in+mammalian+cells.">Splicing promotes rapid and efficient mRNA export in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3386-3391 (2008).</li><li>Palazzo, A. F., Eng, C. H., Schlaepfer, D. D., Marcantonio, E. E., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+stabilization+of+microtubules+by+integrin-+and+FAK-facilitated+Rho+signaling.">Localized stabilization of microtubules by integrin- and FAK-facilitated Rho signaling.</a> Science. 303, 836-839 (2004).</li><li>Keller, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proper+alignment+of+the+microscope.">Proper alignment of the microscope.</a> Methods Cell Biol. 72, 45-55 (2003).</li><li>Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+chemical+modification+constraints+into+a+dynamic+programming+algorithm+for+prediction+of+RNA+secondary+structure.">Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7287-7292 (2004).</li><li>G&#246;rlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+signal+sequence+receptor+has+a+second+subunit+and+is+part+of+a+translocation+complex+in+the+endoplasmic+reticulum+as+probed+by+bifunctional+reagents.">The signal sequence receptor has a second subunit and is part of a translocation complex in the endoplasmic reticulum as probed by bifunctional reagents.</a> J. Cell Biol. 111, 2283-2294 (1990).</li><li>Perales, R., Bentley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Cotranscriptionality":+the+transcription+elongation+complex+as+a+nexus+for+nuclear+transactions.">"Cotranscriptionality": the transcription elongation complex as a nexus for nuclear transactions.</a> Mol. Cell. 36, 178-191 (2009).</li><li>Buratowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+through+the+RNA+polymerase+II+CTD+cycle.">Progression through the RNA polymerase II CTD cycle.</a> Mol. Cell. 36, 541-546 (2009).</li><li>Maniatis, T., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extensive+network+of+coupling+among+gene+expression+machines.">An extensive network of coupling among gene expression machines.</a> Nature. 416, 499-506 (2002).</li><li>Carter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+copy+number+estimation+using+a+mouse+whole-genome+oligonucleotide+microarray.">Transcript copy number estimation using a mouse whole-genome oligonucleotide microarray.</a> Genome Biol. 6, 61-61 (2005).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Microinjection هو أداة قوية يمكن استخدامها لدراسة عدد من العمليات الخلوية المختلفة. خلافا ترنسفكأيشن الخلية التقليدية ، microinjection يسمح للباحث أن أعرض على نحو فعال الأحماض النووية في نوى الخلايا خلال فترة زمنية ضيقة جدا. نتيجة لذلك ، يمكن للمرء أن إجراء تحليلات الحركية مثل تحديد أسعار التصدير مرنا والتطويع اللغوي مرنا ، وتخليق البروتين. وعلاوة على ذلك ، لأن الإطار الزمني لهذه التجربة هي قصيرة نسبيا ، يمكن للمرء أن يعرض الخلايا إلى مركبات سامة داخل فترات زمنية قصيرة دون تكبد آثار عديد المظاهر. وعلاوة على ذلك ، يمكن المثبطة أو تنشيطية المركبات مثل البروتينات السلبية السائدة ، وشارك في حقن مع الأحماض النووية. أخيرا ، تجنب microinjections شرط الكواشف ترنسفكأيشن ، التي غالبا ما تكون سامة للخلايا ، ويمكن التشويش على الخليوي وظائف مختلفة. مرنا مقابل حقن الحمض النووي البلازميد اختيار منها الحمض النووي لحقن سيعتمد على عدد من الاعتبارات. التالية البلازميد حقن الحمض النووي ، والجيش الملكي النيبالي الثاني بوليميريز ليس فقط يجمع مرنا ، ولكن أيضا من العوامل المجندين البروتين لنص 12،13 الوليدة. منذ هذه العوامل تحكم الأحداث مثل تجهيز مرنا ، تصدير المواد النووية والتوطين حشوية ، يمكن استخدام حقن الحمض النووي البلازميد لتقييم كيف يقترن النسخ لعمليات المصب. وإن كان من الممكن أن يقترن النسخ لتصدير المواد النووية 14 ، وجدنا أن يتم تصدير مرنا حقن أسرع قليلا مما كان عليه في كتب مرنا فيفو 6. أسباب ذلك ليست واضحة في الوقت الراهن ، ولكن هذه النتيجة قد تشير إلى أن مرنا كما مركبة جديدة تنبثق من الحمض النووي الريبي البلمرة الثاني ، قد تكون مرتبطة أنه حتى في المجمعات التي تؤخر تصدير المواد النووية. هناك بعض المزايا مع حقن مرنا. أولا ، لا يملك الباحث في استخدام مثبطات البلمرة الجيش الملكي النيبالي ، والتي قد تؤثر على كيفية خلايا تنظيم عملية التمثيل الغذائي عموما من الحمض النووي الريبي. ثانيا ، يمكن تعديل الحمض النووي الريبي في المختبر قبل الحقن. على سبيل المثال ، يمكن توليفها مع مختلف mRNAs نظائرها سقف 5 &#39;أو بولي (A) أطوال الذيل من أجل تقييم كيف تؤثر هذه الميزات تصدير المواد النووية 6. ثالثا ، يمكن أن يكون المبلغ المحدد من الحمض النووي الريبي الذي يتم حقنه يقدر تقريبا. بعد بروتوكول المبينة أعلاه ، فإننا نقدر أن يتم حقن حوالي 20،000 إلى 50،000 في كل جزيئات النواة ، التي هي صغيرة نسبيا بالمقارنة مع العدد الكلي للمخطوطات في خلية الثدييات نموذجي (400،000 إلى 850،000 الجزيئات) 15. أما العيب الرئيسي مرنا مع الحقن هو أنه خلال microinjection ، تسرب بعض السوائل الحقن في السيتوبلازم أمر لا مفر منه. منذ مرنا حقنه مباشرة في السيتوبلازم غير مستقرة على مدى فترات طويلة (ألف قصر ، والمراقبة غير منشورة) ، يجب اتخاذ المزيد من الحيطة لتحديد الخلايا التي كميا. عموما نحن نحلل الخلايا التي تلقت&gt; 90 ٪ من السوائل الحقن في النواة ، وفقا لتقييم توزيع OG - ديكستران.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Injection buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>140 mM KCl and 10 mM HEPES, pH 7.4</td>
</tr>
<tr>
<td>Oregon Green 488-70kD Dextran</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D7173</td>
<td>Stock of 10mg/ml in injection buffer can be stored for longs periods of time at -80&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Borosilicate capillary tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>1B100F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gel loading pipette tips for loading injection needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>022351656</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>Eclipse Ti-S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige Group</td>
<td>NT-88-V3MSH</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe for injection</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>512311</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4</td>
</tr>
<tr>
<td>SSC Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.4</td>
</tr>
<tr>
<td>4% Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>15686</td>
<td>Stock of 37% Paraformaldehyde is diluted in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>0.1% Triton X-100 (Surfact-Amps)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>28314</td>
<td>Stock of 10% Triton X-100 is diluted in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Formamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fischer Scientific</td>
<td>F84-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran sulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fischer Scientific</td>
<td>BP1585-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E. coli tRNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>R1753</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vanadyl riboside complex (VRC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>R3380</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Whatman filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>28298-020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vibration control table</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kinetic Systems</td>
<td>5702E-3036-21</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluoromount G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Southern Biotech</td>
<td>0100-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&alpha;-amanitin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>A2263</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parafilm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-374-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vacuum Grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>695400008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T7 RNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>M0251S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly(A) Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hybridization Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>100mg/ml dextran sulfate, 5mM VRC, 150mM NaCl, 15mM sodium citrate, 0.5mg/ml E. coli tRNA, 60% formamide</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

analysis of mrna nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection

في حقيقيات النوى ، وكتب رسول الحمض النووي الريبي (الرنا) في النواة ، ويجب أن يتم تصديرها إلى السيتوبلازم للوصول إلى آلية الترجمة. على الرغم من انه تمت دراسة تصدير المواد النووية من مرنا نطاق واسع في البويضات القيطم 1 لين العريكة وراثيا والكائنات مثل الخميرة (2) وذبابة الفاكهة المستمدة خط S2 الخلية 3 ، وقد أجريت دراسات قليلة في خلايا الثدييات. وعلاوة على ذلك يمكن فقط حركية التصدير مرنا في الخلايا الجسمية الثدييات يمكن الاستدلال 4،5 بشكل غير مباشر. من أجل قياس حركية تصدير المواد النووية من خلايا الثدييات مرنا في زراعة الأنسجة ، وطورنا مقايسة التي توظف قوة microinjection مقرونا فلوري التهجين في الموضع (FISH). وقد استخدمت هذه المقايسات لإثبات أن في خلايا الثدييات ، ويتم تصدير معظم mRNAs بطريقة تعتمد على الربط 6،7 ، أو في الطريقة التي تتطلب تسلسل الحمض النووي الريبي معينة مثل الإشارة المنطقة تسلسل الترميز (SSCR) 6. في هذا الاختبار ، يتم microinjected الخلايا في المختبر إما مع مرنا توليفها أو DNA البلازميد الذي يحتوي على الجينات في المصالح. يتم تحضين الخلايا microinjected للحصول على نقاط زمنية مختلفة ومحددة ثم يتم تقييم الترجمة شبه الخلوية باستخدام الحمض النووي الريبي من الأسماك. على النقيض من ترنسفكأيشن ، حيث النسخ تحدث عدة ساعات بعد إضافة الأحماض النووية ، microinjection من الحمض النووي أو مرنا يتيح للتعبير السريع ويسمح لتوليد البيانات الحركية الدقيقة.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection at JoVE.com

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

نحن هنا وصفا للمقايسة التي توظف قوة microinjection مقرونا الفلورسنت<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين من أجل قياس دقيق لحركية التصدير النووي في الخلايا الجسدية مرنا الثدييات.

تحليل حركية مرنا الصادرات النووية في خلايا الثدييات التي Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

Microinjection من مرنا والعقاقير [أليغنوكليوتيد] Morpholino اسماك الزرد في الأجنة.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Intranuclear Microinjection من الحمض النووي في الخلايا العصبية فصل الثدييات الكبار

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

نبض مطاردة تحليل سلاسل السكر N - الموصولة من جليكوبروتينات في خلايا الثدييات

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

تحليل مزدوج الجديلة إصلاح الحمض النووي (DSB) فاصل في خلايا الثدييات

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

الطفرات والتحليل الوظيفي للقنوات ايون أعربت Heterologously في خلايا الثدييات

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

تفعيل موت الخلايا المبرمج من قبل Microinjection هيولي من السيتوكروم ج</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

قياس حركية النسخ مرنا في الخلايا الحية واحدة

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

تحليل المركز دورة الخلية في خلايا الثدييات

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

تقييم الانتقائية مرنا الترجمة في خلايا الثدييات من قبل Polysome التنميط

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

برازي تحليل جلايكورتيكود: رصد الغدة الكظرية غير الغازية في الخيليات

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...