Name: analysis of mrna nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection
Uploaded: 2010-12-04T13:00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection at JoVE.com

We willen graag E. Gomes bedanken voor nuttige adviezen en A. Wilde voor het toestaan ​​van ons om diverse apparatuur te gebruiken. Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​aan AFP van het Canadese Institute for Health Research (FRN 102.725).

<ol>
	<li>Luo, M. J., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+is+required+for+rapid+and+efficient+mRNA+export+in+metazoans.">Splicing is required for rapid and efficient mRNA export in metazoans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 14937-14942 (1999).</li><li>Bossie, M. A., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+of+macromolecules+between+the+cytoplasm+and+the+nucleus+in+yeast.">Movement of macromolecules between the cytoplasm and the nucleus in yeast.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 2, 768-774 (1992).</li><li>Farny, N. G., Hurt, J. A., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+global+and+transcript-specific+mRNA+export+pathways+in+metazoans.">Definition of global and transcript-specific mRNA export pathways in metazoans.</a> Genes Dev. 22, 66-78 (2008).</li><li>Audibert, A., Weil, D., Dautry, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+kinetics+of+mRNA+splicing+and+transport+in+mammalian+cells.">In vivo kinetics of mRNA splicing and transport in mammalian cells.</a> Mol. Cell. Biol. 22, 6706-6718 (2002).</li><li>Snaar, S. P., Verdijk, P., Tanke, H. J., Dirks, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+HCMV+immediate+early+mRNA+expression+in+stably+transfected+fibroblasts.">Kinetics of HCMV immediate early mRNA expression in stably transfected fibroblasts.</a> J. Cell. Sci. 115, 321-328 (2002).</li><li>Palazzo, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+signal+sequence+coding+region+promotes+nuclear+export+of+mRNA.">The signal sequence coding region promotes nuclear export of mRNA.</a> PLoS Biol. 5, e322-e322 (2007).</li><li>Valencia, P., Dias, A. P., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+promotes+rapid+and+efficient+mRNA+export+in+mammalian+cells.">Splicing promotes rapid and efficient mRNA export in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3386-3391 (2008).</li><li>Palazzo, A. F., Eng, C. H., Schlaepfer, D. D., Marcantonio, E. E., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+stabilization+of+microtubules+by+integrin-+and+FAK-facilitated+Rho+signaling.">Localized stabilization of microtubules by integrin- and FAK-facilitated Rho signaling.</a> Science. 303, 836-839 (2004).</li><li>Keller, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proper+alignment+of+the+microscope.">Proper alignment of the microscope.</a> Methods Cell Biol. 72, 45-55 (2003).</li><li>Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+chemical+modification+constraints+into+a+dynamic+programming+algorithm+for+prediction+of+RNA+secondary+structure.">Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7287-7292 (2004).</li><li>G&#246;rlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+signal+sequence+receptor+has+a+second+subunit+and+is+part+of+a+translocation+complex+in+the+endoplasmic+reticulum+as+probed+by+bifunctional+reagents.">The signal sequence receptor has a second subunit and is part of a translocation complex in the endoplasmic reticulum as probed by bifunctional reagents.</a> J. Cell Biol. 111, 2283-2294 (1990).</li><li>Perales, R., Bentley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Cotranscriptionality":+the+transcription+elongation+complex+as+a+nexus+for+nuclear+transactions.">"Cotranscriptionality": the transcription elongation complex as a nexus for nuclear transactions.</a> Mol. Cell. 36, 178-191 (2009).</li><li>Buratowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+through+the+RNA+polymerase+II+CTD+cycle.">Progression through the RNA polymerase II CTD cycle.</a> Mol. Cell. 36, 541-546 (2009).</li><li>Maniatis, T., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extensive+network+of+coupling+among+gene+expression+machines.">An extensive network of coupling among gene expression machines.</a> Nature. 416, 499-506 (2002).</li><li>Carter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+copy+number+estimation+using+a+mouse+whole-genome+oligonucleotide+microarray.">Transcript copy number estimation using a mouse whole-genome oligonucleotide microarray.</a> Genome Biol. 6, 61-61 (2005).</li></ol>

Micro-injectie is een krachtig instrument dat kan worden gebruikt om een ​​aantal verschillende cellulaire processen te bestuderen. In tegenstelling tot conventionele celtransfectie, micro-injectie kan de onderzoeker om effectief nucleïnezuren te introduceren in de cellulaire kernen binnen een zeer korte periode aan. Als gevolg daarvan kan men uitvoeren kinetische analyses zoals het bepalen van de tarieven van mRNA export, mRNA lokalisatie en de eiwitsynthese. Aangezien de looptijd van het experiment is relatief kort, kan men blootstellen cellen toxische stoffen binnen korte tijd overspanning zonder dat pleiotrope effecten. Bovendien kan remmende of stimulerende verbindingen zoals dominant negatief eiwitten, worden co-geïnjecteerd met de nucleïnezuren. Tot slot, micro-injecties voorkomen dat de eis voor transfectiereagentia, die vaak giftig voor cellen en kunnen verstoren verschillende cellulaire functies. mRNA vs plasmide DNA injecties De keuze van de nucleïnezuur te injecteren zal afhangen van een aantal overwegingen. Naar aanleiding van plasmide DNA injectie, RNA polymerase II niet alleen synthetiseert mRNA, maar ook rekruten eiwit factoren om de ontluikende transcript 12,13. Aangezien deze factoren bepalen evenementen zoals mRNA verwerking, de nucleaire export-en cytoplasmatische lokalisatie, kan plasmide DNA injecties worden gebruikt om te beoordelen hoe transcriptie is gekoppeld aan downstream-processen. Hoewel de transcriptie kan worden gekoppeld aan de nucleaire export 14, hebben we gemerkt dat ingespoten mRNA is iets sneller dan in vivo getranscribeerd mRNA 6 geëxporteerd. De redenen hiervoor zijn niet duidelijk op dit moment, maar dit resultaat kan erop wijzen dat als nieuw gesynthetiseerde mRNA blijkt uit RNA polymerase II, kan het vast in complexen die vertragen de nucleaire export. Er zijn een aantal voordelen met mRNA injecties. Ten eerste heeft de onderzoeker niet te RNA polymerase-remmers gebruiken, dat kan invloed hebben op hoe de cellen van het totale metabolisme van RNA te reguleren. Ten tweede kan het RNA worden gewijzigd in vitro voorafgaand aan de injectie. Zo kan mRNA&#39;s worden gesynthetiseerd met verschillende 5 &#39;cap-analogen of poly (A) staart lengte om te kunnen beoordelen hoe deze functies nucleaire export 6 beïnvloeden. Ten derde kan het exacte bedrag van RNA die wordt ingespoten ruwweg worden geschat. Naar aanleiding van het protocol hierboven omschreven, we schatten dat ongeveer 20.000 tot 50.000 moleculen worden geïnjecteerd in elke kernen, dat is relatief klein in vergelijking met het totaal aantal transcripten in een typische zoogdiercellen (400.000 tot 850.000 moleculen) 15. Het grote nadeel van mRNA injecties is dat tijdens micro-injectie, een aantal lekken van injectievloeistof in het cytoplasma onvermijdelijk is. Sinds mRNA direct geïnjecteerd in het cytoplasma is stabiel over lange periodes (A. Palazzo, ongepubliceerde waarnemingen), moet extra zorg worden genomen om te selecteren welke cellen worden gekwantificeerd. Over het algemeen analyseren we cellen die&gt; 90% van de injectievloeistof ontvangen in de kern, zoals beoordeeld door de verdeling van OG-dextran.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Injection buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>140 mM KCl and 10 mM HEPES, pH 7.4</td>
</tr>
<tr>
<td>Oregon Green 488-70kD Dextran</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D7173</td>
<td>Stock of 10mg/ml in injection buffer can be stored for longs periods of time at -80&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Borosilicate capillary tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>1B100F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gel loading pipette tips for loading injection needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>022351656</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>Eclipse Ti-S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige Group</td>
<td>NT-88-V3MSH</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe for injection</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>512311</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4</td>
</tr>
<tr>
<td>SSC Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.4</td>
</tr>
<tr>
<td>4% Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>15686</td>
<td>Stock of 37% Paraformaldehyde is diluted in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>0.1% Triton X-100 (Surfact-Amps)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>28314</td>
<td>Stock of 10% Triton X-100 is diluted in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Formamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fischer Scientific</td>
<td>F84-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran sulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fischer Scientific</td>
<td>BP1585-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E. coli tRNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>R1753</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vanadyl riboside complex (VRC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>R3380</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Whatman filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>28298-020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vibration control table</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kinetic Systems</td>
<td>5702E-3036-21</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluoromount G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Southern Biotech</td>
<td>0100-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&alpha;-amanitin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>A2263</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parafilm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-374-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vacuum Grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>695400008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T7 RNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>M0251S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly(A) Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hybridization Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>100mg/ml dextran sulfate, 5mM VRC, 150mM NaCl, 15mM sodium citrate, 0.5mg/ml E. coli tRNA, 60% formamide</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

analysis of mrna nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection

In eukaryoten, is messenger RNA (mRNA) getranscribeerd in de kern en moet worden geëxporteerd naar het cytoplasma naar de vertaling toegang machines. Hoewel de nucleaire export van mRNA is uitgebreid bestudeerd in Xenopus oöcyten 1 en genetisch handelbaar organismen zoals gist 2 en de Drosophila afgeleid S2 cellijn 3, hadden weinig studies zijn uitgevoerd in zoogdiercellen. Verder is de kinetiek van mRNA export in somatische cellen van zoogdieren kan alleen worden afgeleid indirect 4,5. Met het oog op de nucleaire export kinetiek van mRNA in zoogdieren weefselkweek cellen te meten, hebben we een test dat de kracht van micro-injectie in combinatie met fluorescente in situ hybridisatie (FISH) in dienst heeft. Deze testen zijn gebruikt om aan te tonen dat in zoogdiercellen, het merendeel van de mRNA&#39;s worden uitgevoerd in een splicing afhankelijke manier 6,7, of op een wijze die specifieke RNA-sequenties, zoals de signaalsequentie coderende gebied (SSCR) 6 vereist. In deze test worden cellen gemicroinjecteerd met ofwel in vitro gesynthetiseerd mRNA of plasmide DNA dat het gen van belang. De gemicroinjecteerd cellen worden geïncubeerd gedurende verschillende tijdstippen dan de vaste en de sub-cellulaire lokalisatie van RNA wordt beoordeeld op basis FISH. In tegenstelling tot transfectie, waar transcriptie enkele uren ontstaat na de toevoeging van nucleïnezuren, micro-injectie van DNA of mRNA zorgt voor een snelle expressie en zorgt voor het genereren van nauwkeurige kinetische gegevens.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection at JoVE.com

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

Hier beschrijven we een test dat de kracht van micro-injectie in combinatie met fluorescerende werken<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie om nauwkeurig de nucleaire export kinetiek van mRNA te meten in somatische cellen van zoogdieren.

Analyse van de mRNA Nuclear Export Kinetics in zoogdiercellen door micro-injectie

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

Micro-injectie van mRNA en morfolino antisense oligonucleotiden in zebravis embryo&#39;s.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Intranucleaire micro-injectie van DNA in gedissocieerde Adult zoogdieren Neuronen

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Pulse-chase analyse van N-gebonden suikerketens van glycoproteïnen in zoogdiercellen

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

Analyse van DNA dubbelstrengs breuken (DSB) Reparatie in zoogdiercellen

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagenese en Functionele analyse van ionenkanalen heteroloog Uitgedrukt in zoogdiercellen

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activering van apoptose door Cytoplasmatische micro-injectie van Cytochroom C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

Het meten van de kinetiek van mRNA transcriptie in Single levende cellen

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Analyse van celcyclus Positie in zoogdiercellen

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Beoordeling van Selectieve mRNA Vertaling in zoogdiercellen door polysoom Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Fecale Glucocorticoïd Analyse: Niet-invasieve bijnier Toezicht op Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...