Name: analysis of mrna nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection
Uploaded: 2010-12-04T13:00:00
Duration: 11 min 32 s
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Nous tenons à remercier E. Gomes conseils utiles et A. Wilde pour nous permettre d&#39;utiliser divers équipements. Ce travail a été soutenu par une subvention à l&#39;AFP par l&#39;Institut canadien de recherche en santé (FRN 102725).

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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proper+alignment+of+the+microscope.">Proper alignment of the microscope.</a> Methods Cell Biol. 72, 45-55 (2003).</li><li>Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+chemical+modification+constraints+into+a+dynamic+programming+algorithm+for+prediction+of+RNA+secondary+structure.">Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7287-7292 (2004).</li><li>G&#246;rlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+signal+sequence+receptor+has+a+second+subunit+and+is+part+of+a+translocation+complex+in+the+endoplasmic+reticulum+as+probed+by+bifunctional+reagents.">The signal sequence receptor has a second subunit and is part of a translocation complex in the endoplasmic reticulum as probed by bifunctional reagents.</a> J. Cell Biol. 111, 2283-2294 (1990).</li><li>Perales, R., Bentley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Cotranscriptionality":+the+transcription+elongation+complex+as+a+nexus+for+nuclear+transactions.">"Cotranscriptionality": the transcription elongation complex as a nexus for nuclear transactions.</a> Mol. Cell. 36, 178-191 (2009).</li><li>Buratowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+through+the+RNA+polymerase+II+CTD+cycle.">Progression through the RNA polymerase II CTD cycle.</a> Mol. Cell. 36, 541-546 (2009).</li><li>Maniatis, T., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extensive+network+of+coupling+among+gene+expression+machines.">An extensive network of coupling among gene expression machines.</a> Nature. 416, 499-506 (2002).</li><li>Carter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+copy+number+estimation+using+a+mouse+whole-genome+oligonucleotide+microarray.">Transcript copy number estimation using a mouse whole-genome oligonucleotide microarray.</a> Genome Biol. 6, 61-61 (2005).</li></ol>

La microinjection est un outil puissant qui peut être utilisé pour étudier un certain nombre de différents processus cellulaires. Contrairement à la transfection de cellules conventionnelles, la microinjection permet au chercheur d&#39;introduire efficacement des acides nucléiques dans les noyaux cellulaires dans un délai très étroites. En conséquence, on peut effectuer des analyses cinétiques tels que la détermination des taux d&#39;ARNm de l&#39;exportation, la localisation d&#39;ARNm et la synthèse des protéines. En outre, depuis le calendrier de l&#39;expérience est relativement brève, on peut exposer des cellules à des composés toxiques dans les intervalles de temps courts, sans encourir des effets pléiotropes. Par ailleurs, les composés inhibiteurs ou stimulants tels que les protéines dominante négative, peut être co-injectées avec les acides nucléiques. Enfin, microinjections d&#39;éviter l&#39;obligation de réactifs de transfection, qui sont souvent toxiques pour les cellules et peuvent perturber les fonctions cellulaires différents. ARNm vs injections d&#39;ADN plasmidique Le choix de l&#39;acide nucléique à injecter dépendra d&#39;un certain nombre de considérations. Après l&#39;injection d&#39;ADN plasmidique, l&#39;ARN polymérase II non seulement synthétise l&#39;ARNm, mais recrute aussi des facteurs protéiques de la transcription naissante 12,13. Puisque ces facteurs régissent le traitement des événements tels que l&#39;ARNm, l&#39;exportation nucléaire et de la localisation cytoplasmique, les injections d&#39;ADN plasmidique peut être utilisé pour évaluer la façon dont la transcription est couplée à des processus en aval. Bien que la transcription peut être couplé à l&#39;exportation nucléaire 14, nous avons constaté que l&#39;ARNm injecté est exportée légèrement plus rapide que dans les ARNm transcrit in vivo 6. Les raisons de ce ne sont pas claires pour le moment, mais ce résultat peut suggérer que l&#39;ARNm nouvellement synthétisés se dégage de l&#39;ARN polymérase II, il peut être immobilisé dans des complexes qui retardent l&#39;exportation nucléaire. Il ya certains avantages à des injections d&#39;ARNm. Premièrement, le chercheur n&#39;a pas à utiliser des inhibiteurs de l&#39;ARN polymérase, qui pourrait affecter la façon dont les cellules réguler le métabolisme global de l&#39;ARN. Deuxièmement, l&#39;ARN peut être modifiée in vitro avant l&#39;injection. Par exemple, les ARNm peuvent être synthétisés avec divers analogues de bouchon 5 &#39;ou de poly (A) des longueurs de queue, afin d&#39;évaluer comment ces caractéristiques affectent les exportations nucléaires 6. Troisièmement, le montant exact de l&#39;ARN qui est injecté peut être grossièrement estimé. En suivant le protocole décrit ci-dessus, nous estimons qu&#39;environ 20.000 à 50.000 molécules sont injectées dans chaque noyau, qui est relativement faible comparé au nombre total de transcriptions dans une cellule de mammifère typique (400.000 à 850.000 molécules) 15. L&#39;inconvénient majeur avec des injections d&#39;ARNm est que pendant la microinjection, une fuite du fluide d&#39;injection dans le cytoplasme est inévitable. Depuis ARNm injecté directement dans le cytoplasme est stable sur de longues périodes (A. Palazzo, observation non publiée), des précautions supplémentaires doivent être prises pour sélectionner les cellules sont quantifiées. Généralement, nous analysons les cellules qui ont reçu&gt; 90% de l&#39;injection de fluide dans le noyau, tel qu&#39;évalué par la distribution de l&#39;OG-dextran.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Injection buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>140 mM KCl and 10 mM HEPES, pH 7.4</td>
</tr>
<tr>
<td>Oregon Green 488-70kD Dextran</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D7173</td>
<td>Stock of 10mg/ml in injection buffer can be stored for longs periods of time at -80&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Borosilicate capillary tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>1B100F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gel loading pipette tips for loading injection needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>022351656</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>Eclipse Ti-S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige Group</td>
<td>NT-88-V3MSH</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe for injection</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>512311</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4</td>
</tr>
<tr>
<td>SSC Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.4</td>
</tr>
<tr>
<td>4% Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>15686</td>
<td>Stock of 37% Paraformaldehyde is diluted in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>0.1% Triton X-100 (Surfact-Amps)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>28314</td>
<td>Stock of 10% Triton X-100 is diluted in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Formamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fischer Scientific</td>
<td>F84-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran sulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fischer Scientific</td>
<td>BP1585-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E. coli tRNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>R1753</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vanadyl riboside complex (VRC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>R3380</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Whatman filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>28298-020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vibration control table</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kinetic Systems</td>
<td>5702E-3036-21</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluoromount G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Southern Biotech</td>
<td>0100-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&alpha;-amanitin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>A2263</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parafilm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-374-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vacuum Grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>695400008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T7 RNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>M0251S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly(A) Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hybridization Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>100mg/ml dextran sulfate, 5mM VRC, 150mM NaCl, 15mM sodium citrate, 0.5mg/ml E. coli tRNA, 60% formamide</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

analysis of mrna nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection

Chez les eucaryotes, l&#39;ARN messager (ARNm) est transcrit dans le noyau et doivent être exportés dans le cytoplasme d&#39;accéder à la machinerie de traduction. Bien que les exportations nucléaires de l&#39;ARNm a été largement étudié dans des ovocytes de Xénope 1 et les organismes génétiquement traitables comme la levure et la drosophile deux lignée dérivée de cellules S2 3, peu d&#39;études avaient été menées dans les cellules de mammifères. De plus la cinétique de l&#39;exportation d&#39;ARNm dans les cellules somatiques de mammifères ne pouvaient être déduites indirectement à 4,5. Afin de mesurer la cinétique de l&#39;exportation nucléaire de l&#39;ARNm dans les cellules de culture de tissus de mammifères, nous avons développé un test qui utilise la puissance du micro-injection couplé avec d&#39;hybridation fluorescente in situ (FISH). Ces tests ont été utilisés pour démontrer que des cellules de mammifères, la majorité des ARNm sont exportés de manière épissage dépendants 6,7, ou de manière qui exige des séquences spécifiques d&#39;ARN tels que la région séquence signal de codage (SSCR) 6. Dans cet essai, les cellules sont microinjectés soit in vitro avec des ARNm synthétisés ou ADN plasmidique contenant le gène d&#39;intérêt. Les cellules sont incubées pendant microinjectés divers moments alors fixé et la localisation sous-cellulaire des ARN est évaluée en utilisant FISH. Contrairement à la transfection, où la transcription a lieu plusieurs heures après l&#39;ajout d&#39;acides nucléiques, la microinjection d&#39;ADN ou d&#39;ARNm permet l&#39;expression rapide et permet de générer des données précises cinétique.

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Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

Nous décrivons ici un test qui utilise la puissance du micro-injection couplé à fluorescence<em&gt; In situ</emL&#39;hybridation&gt; afin de mesurer avec précision la cinétique de l&#39;exportation nucléaire de l&#39;ARNm dans les cellules somatiques de mammifères.

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