Name: analysis of mrna nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection
Uploaded: 2010-12-04T13:00:00
Duration: 11 min 32 s
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Wir möchten E. Gomes für nützliche Ratschläge und A. Wilde danken für die Erlaubnis, verschiedene Geräte zu verwenden. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss zu AFP vom Canadian Institute for Health Research (FRN 102725) unterstützt.

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	<li>Luo, M. J., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+is+required+for+rapid+and+efficient+mRNA+export+in+metazoans.">Splicing is required for rapid and efficient mRNA export in metazoans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 14937-14942 (1999).</li><li>Bossie, M. A., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+of+macromolecules+between+the+cytoplasm+and+the+nucleus+in+yeast.">Movement of macromolecules between the cytoplasm and the nucleus in yeast.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 2, 768-774 (1992).</li><li>Farny, N. G., Hurt, J. A., Silver, P. 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P., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+promotes+rapid+and+efficient+mRNA+export+in+mammalian+cells.">Splicing promotes rapid and efficient mRNA export in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3386-3391 (2008).</li><li>Palazzo, A. F., Eng, C. H., Schlaepfer, D. D., Marcantonio, E. E., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+stabilization+of+microtubules+by+integrin-+and+FAK-facilitated+Rho+signaling.">Localized stabilization of microtubules by integrin- and FAK-facilitated Rho signaling.</a> Science. 303, 836-839 (2004).</li><li>Keller, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proper+alignment+of+the+microscope.">Proper alignment of the microscope.</a> Methods Cell Biol. 72, 45-55 (2003).</li><li>Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+chemical+modification+constraints+into+a+dynamic+programming+algorithm+for+prediction+of+RNA+secondary+structure.">Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7287-7292 (2004).</li><li>G&#246;rlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+signal+sequence+receptor+has+a+second+subunit+and+is+part+of+a+translocation+complex+in+the+endoplasmic+reticulum+as+probed+by+bifunctional+reagents.">The signal sequence receptor has a second subunit and is part of a translocation complex in the endoplasmic reticulum as probed by bifunctional reagents.</a> J. Cell Biol. 111, 2283-2294 (1990).</li><li>Perales, R., Bentley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Cotranscriptionality":+the+transcription+elongation+complex+as+a+nexus+for+nuclear+transactions.">"Cotranscriptionality": the transcription elongation complex as a nexus for nuclear transactions.</a> Mol. Cell. 36, 178-191 (2009).</li><li>Buratowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+through+the+RNA+polymerase+II+CTD+cycle.">Progression through the RNA polymerase II CTD cycle.</a> Mol. Cell. 36, 541-546 (2009).</li><li>Maniatis, T., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extensive+network+of+coupling+among+gene+expression+machines.">An extensive network of coupling among gene expression machines.</a> Nature. 416, 499-506 (2002).</li><li>Carter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+copy+number+estimation+using+a+mouse+whole-genome+oligonucleotide+microarray.">Transcript copy number estimation using a mouse whole-genome oligonucleotide microarray.</a> Genome Biol. 6, 61-61 (2005).</li></ol>

Mikroinjektion ist ein leistungsstarkes Tool, mit dem eine Reihe von verschiedenen zellulären Prozessen untersucht werden können. Im Gegensatz zu herkömmlichen Zelltransfektion erlaubt Mikroinjektion der Wissenschaftler effektiv einzuführen Nukleinsäuren in die Zellkerne in einem sehr engen Zeitrahmen. Als Ergebnis kann man kinetische Analysen wie die Bestimmung der Preise von mRNA export, mRNA-Lokalisierung, und die Proteinsynthese führen. Darüber hinaus, da der Zeitrahmen des Experiments relativ kurz ist, kann man Zellen toxische Verbindungen innerhalb kurzer Zeitspannen ohne dass pleiotrope Effekte aufzudecken. Darüber hinaus können hemmende oder stimulierende Verbindungen wie dominant negative Proteine, mit der Nukleinsäuren co-injiziert werden. Schließlich vermeiden microinjections die Forderung nach der Transfektion Reagenzien, die oft toxisch für Zellen und können unterschiedliche zelluläre Funktionen stören. mRNA vs Plasmid-DNA-Injektionen Die Wahl der Nukleinsäure zu spritzen auf eine Reihe von Überlegungen abhängen wird. Nach Plasmid-DNA Injektion, RNA Polymerase II nicht nur synthetisiert mRNA, sondern auch Rekruten Protein Faktoren, die im Entstehen begriffenen Transkript 12,13. Da diese Faktoren Veranstaltungen wie mRNA-Prozessierung, nukleare Export und zytoplasmatische Lokalisation regieren, können Plasmid-DNA-Injektionen verwendet werden, um einzuschätzen, wie Transkription, um nachgelagerte Prozesse gekoppelt werden. Obwohl die Transkription zu Kernexport 14 gekoppelt werden kann, haben wir festgestellt, dass injizierte mRNA etwas schneller als in vivo transkribierten mRNA 6 exportiert. Die Gründe dafür sind im Moment nicht klar, aber dieses Ergebnis könnte darauf hindeuten, dass die neu synthetisierten mRNA von RNA-Polymerase II entsteht, kann es bis in Komplexen, die verzögern Kernexport gebunden werden. Es gibt einige Vorteile, die mit mRNA Injektionen. Zunächst muss der Forscher nicht zu RNA-Polymerase-Inhibitoren, die beeinflussen könnten, wie Zellen den gesamten Metabolismus von RNA zu regulieren. Zweitens kann die RNA in vitro modifiziert werden, bevor Injektion. Zum Beispiel können mRNAs mit verschiedenen 5&#39;-Cap-Analoga oder Poly (A)-Schwanz Länge synthetisiert werden, um zu beurteilen, wie diese Funktionen nuklearen Export 6 beeinflussen. Drittens kann die genaue Menge an RNA, die injiziert wird grob geschätzt werden. Nach dem Protokoll skizzierten schätzen wir, dass etwa 20.000 bis 50.000 Molekülen in jedem Kerne, die relativ klein ist injiziert werden, wenn die Gesamtzahl der Transkripte in einer typischen Säugerzelle (400.000 bis 850.000 Moleküle) 15 verglichen. Der größte Nachteil mit mRNA-Injektionen besteht darin, dass während der Mikroinjektion, eine Leckage von Injektionsflüssigkeit in das Zytoplasma unvermeidbar ist. Da mRNA direkt in das Zytoplasma injiziert wird über lange Zeiträume (A. Palazzo, unveröffentlichte Beobachtung) stabil ist, muss besonders sorgfältig auswählen, welche Zellen quantifiziert werden. Generell analysieren wir Zellen, die&gt; 90% der Injektionsflüssigkeit in den Zellkern, wie durch die Verteilung der OG-Dextran beurteilt wurde.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Injection buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>140 mM KCl and 10 mM HEPES, pH 7.4</td>
</tr>
<tr>
<td>Oregon Green 488-70kD Dextran</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D7173</td>
<td>Stock of 10mg/ml in injection buffer can be stored for longs periods of time at -80&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Borosilicate capillary tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>1B100F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gel loading pipette tips for loading injection needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>022351656</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>Eclipse Ti-S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige Group</td>
<td>NT-88-V3MSH</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe for injection</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>512311</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4</td>
</tr>
<tr>
<td>SSC Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.4</td>
</tr>
<tr>
<td>4% Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>15686</td>
<td>Stock of 37% Paraformaldehyde is diluted in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>0.1% Triton X-100 (Surfact-Amps)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>28314</td>
<td>Stock of 10% Triton X-100 is diluted in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Formamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fischer Scientific</td>
<td>F84-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran sulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fischer Scientific</td>
<td>BP1585-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E. coli tRNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>R1753</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vanadyl riboside complex (VRC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>R3380</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Whatman filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>28298-020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vibration control table</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kinetic Systems</td>
<td>5702E-3036-21</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluoromount G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Southern Biotech</td>
<td>0100-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&alpha;-amanitin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>A2263</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parafilm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-374-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vacuum Grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>695400008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T7 RNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>M0251S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly(A) Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hybridization Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>100mg/ml dextran sulfate, 5mM VRC, 150mM NaCl, 15mM sodium citrate, 0.5mg/ml E. coli tRNA, 60% formamide</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

analysis of mrna nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection

In Eukaryoten ist messenger RNA (mRNA) in den Zellkern transkribiert und muss in das Zytoplasma der Übersetzung Maschinen Zugriff exportiert werden. Obwohl die nuklearen Export von mRNA wurde ausgiebig in Xenopus Oozyten 1 und genetisch manipulierbaren Organismen wie Hefe-2 und der Drosophila abgeleitet S2 Zelle Linie 3 studierte, hatten nur wenige Studien in Säugerzellen durchgeführt. Darüber hinaus die Kinetik der mRNA export in somatischen Zellen von Säugetieren können nur geschlossen indirekt 4,5 sein. Um die Kernexport Kinetik der mRNA in Säugetierzellen Gewebekulturzellen zu messen, haben wir einen Test, der die Macht der Mikroinjektion mit Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) gekoppelt beschäftigt entwickelt. Diese Assays wurden verwendet, um nachzuweisen, dass in Säugerzellen, die Mehrheit der mRNAs in einem Spleißen abhängigen Weise 6,7 exportiert werden, oder in Art und Weise, dass spezifische RNA-Sequenzen, wie die Signalsequenz kodierende Region (SSCR) 6 erfordert. In diesem Test werden die Zellen entweder mit in vitro synthetisierten mRNA-oder Plasmid-DNA mit dem Gen von Interesse mikroinjiziert. Die mikroinjiziert Zellen sind für verschiedene Zeitpunkte dann fixiert und die sub-zelluläre Lokalisation von RNA wird anhand FISH inkubiert. Im Gegensatz zu Transfektion, wo die Transkription erfolgt einige Stunden nach der Zugabe von Nukleinsäuren, ermöglicht die Mikroinjektion von DNA oder mRNA für eine schnelle Ausdruck und erlaubt die Erzeugung von präzise kinetische Daten.

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Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

Hier beschreiben wir einen Test, dass die Macht der Mikroinjektion mit fluoreszierenden gekoppelt beschäftigt<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung, um die genaue Messung der Kernexport Kinetik der mRNA in somatischen Zellen von Säugetieren.

Die Analyse der mRNA Nuclear Export Kinetics in Säugerzellen durch Mikroinjektion

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Research

JoVE Journal

Biology

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Forschung

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