Name: analysis of mrna nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection
Uploaded: 2010-12-04T13:00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection at JoVE.com

ברצוננו להודות גומז א עצה שימושית וא ויילד עבור ומאפשר לנו להשתמש בציוד שונים. עבודה זו נתמכה על ידי מענק כדי AFP מן המכון הקנדי לבריאות מחקר (FRN 102,725).

<ol>
	<li>Luo, M. J., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+is+required+for+rapid+and+efficient+mRNA+export+in+metazoans.">Splicing is required for rapid and efficient mRNA export in metazoans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 14937-14942 (1999).</li><li>Bossie, M. A., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+of+macromolecules+between+the+cytoplasm+and+the+nucleus+in+yeast.">Movement of macromolecules between the cytoplasm and the nucleus in yeast.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 2, 768-774 (1992).</li><li>Farny, N. G., Hurt, J. A., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+global+and+transcript-specific+mRNA+export+pathways+in+metazoans.">Definition of global and transcript-specific mRNA export pathways in metazoans.</a> Genes Dev. 22, 66-78 (2008).</li><li>Audibert, A., Weil, D., Dautry, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+kinetics+of+mRNA+splicing+and+transport+in+mammalian+cells.">In vivo kinetics of mRNA splicing and transport in mammalian cells.</a> Mol. Cell. Biol. 22, 6706-6718 (2002).</li><li>Snaar, S. P., Verdijk, P., Tanke, H. J., Dirks, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+HCMV+immediate+early+mRNA+expression+in+stably+transfected+fibroblasts.">Kinetics of HCMV immediate early mRNA expression in stably transfected fibroblasts.</a> J. Cell. Sci. 115, 321-328 (2002).</li><li>Palazzo, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+signal+sequence+coding+region+promotes+nuclear+export+of+mRNA.">The signal sequence coding region promotes nuclear export of mRNA.</a> PLoS Biol. 5, e322-e322 (2007).</li><li>Valencia, P., Dias, A. P., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+promotes+rapid+and+efficient+mRNA+export+in+mammalian+cells.">Splicing promotes rapid and efficient mRNA export in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3386-3391 (2008).</li><li>Palazzo, A. F., Eng, C. H., Schlaepfer, D. D., Marcantonio, E. E., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+stabilization+of+microtubules+by+integrin-+and+FAK-facilitated+Rho+signaling.">Localized stabilization of microtubules by integrin- and FAK-facilitated Rho signaling.</a> Science. 303, 836-839 (2004).</li><li>Keller, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proper+alignment+of+the+microscope.">Proper alignment of the microscope.</a> Methods Cell Biol. 72, 45-55 (2003).</li><li>Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+chemical+modification+constraints+into+a+dynamic+programming+algorithm+for+prediction+of+RNA+secondary+structure.">Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7287-7292 (2004).</li><li>G&#246;rlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+signal+sequence+receptor+has+a+second+subunit+and+is+part+of+a+translocation+complex+in+the+endoplasmic+reticulum+as+probed+by+bifunctional+reagents.">The signal sequence receptor has a second subunit and is part of a translocation complex in the endoplasmic reticulum as probed by bifunctional reagents.</a> J. Cell Biol. 111, 2283-2294 (1990).</li><li>Perales, R., Bentley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Cotranscriptionality":+the+transcription+elongation+complex+as+a+nexus+for+nuclear+transactions.">"Cotranscriptionality": the transcription elongation complex as a nexus for nuclear transactions.</a> Mol. Cell. 36, 178-191 (2009).</li><li>Buratowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+through+the+RNA+polymerase+II+CTD+cycle.">Progression through the RNA polymerase II CTD cycle.</a> Mol. Cell. 36, 541-546 (2009).</li><li>Maniatis, T., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extensive+network+of+coupling+among+gene+expression+machines.">An extensive network of coupling among gene expression machines.</a> Nature. 416, 499-506 (2002).</li><li>Carter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+copy+number+estimation+using+a+mouse+whole-genome+oligonucleotide+microarray.">Transcript copy number estimation using a mouse whole-genome oligonucleotide microarray.</a> Genome Biol. 6, 61-61 (2005).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Microinjection הוא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד מספר תהליכים תאיים שונים. בניגוד transfection התא קונבנציונאלי, microinjection מאפשרת לחוקר ביעילות להציג חומצות גרעין לתוך גרעין התא בתוך פרק זמן צר מאוד. כתוצאה מכך, ניתן לבצע ניתוחים הקינטית כגון קביעת שיעורי הייצוא mRNA, לוקליזציה mRNA, ואת סינתזת החלבון. יתר על כן, מאז הזמן של הניסוי היא קצרה יחסית, ניתן לחשוף תאים תרכובות רעילות בתוך בפרקי זמן קצרים ללא גביית תופעות pleiotropic. יתר על כן, מעכבות או גירוי תרכובות כגון חלבונים שלילי דומיננטי, יכול להיות שותף מוזרק עם חומצות גרעין. לבסוף, microinjections למנוע את הדרישה ריאגנטים transfection, אשר לעתים רעיל לתאים ועלול להפריע תפקודים תאיים שונים. mRNA לעומת זריקות ה-DNA פלסמיד הבחירה בה חומצות גרעין להזריק יהיה תלוי מספר שיקולים. בעקבות הזרקת פלסמיד דנ&quot;א, RNA פולימראז II לא רק מסנתז mRNA, אלא גם מגייסת גורמים חלבון תמליל המתהווה 12,13. מאז גורמים אלה חלים אירועים כגון עיבוד mRNA, יצוא גרעיני לוקליזציה cytoplasmic, זריקות DNA פלסמיד יכול לשמש כדי להעריך כיצד הוא תעתיק מצמידים את תהליכי במורד הזרם. למרות שעתוק עשוי להיות יחד לייצא גרעיני 14, מצאנו כי מזריקים mRNA מיוצא מעט מהר יותר מאשר ב-mRNA עיבד vivo 6. הסיבות לכך אינן ברורות כרגע, אך תוצאה זו עשויה לרמוז כמו mRNA מסונתז החדש עולה RNA פולימראז II, זה עשוי להיות קשור מתחמי כי יצוא לעכב גרעיני. יש כמה יתרונות עם זריקות mRNA. ראשית, החוקר לא חייב להשתמש מעכבי RNA פולימראז, אשר עשוי להשפיע על האופן שבו תאים מווסתים את חילוף החומרים הכללי של רנ&quot;א. שנית, RNA יכול להיות שונה במבחנה לפני הזריקה. למשל, mRNAs יכול להיות מסונתז עם כובע &quot;5 אנלוגים שונים או פולי (א) אורך הזנב על מנת להעריך כיצד תכונות אלה משפיעות על הייצוא הגרעיני 6. שלישית, הסכום המדויק של רנ&quot;א מוזרק ניתן להעריך בגסות. בעקבות פרוטוקול שתוארו לעיל, אנו מעריכים כי כ -20,000 עד 50,000 מולקולות מוזרקים בגרעין אחד, שהוא קטן יחסית בהשוואה למספר הכולל של תמלילי בתא יונקים אופייני (400,000 עד 850,000 מולקולות) 15. החיסרון העיקרי עם זריקות mRNA היא כי במהלך microinjection, כמה דליפה של נוזל הזרקה לתוך הציטופלסמה היא בלתי נמנעת. מאז ה-mRNA מוזרק ישירות לתוך הציטופלסמה היא יציבה לאורך תקופות ארוכות (א Palazzo, תצפית לא פורסם), טיפול נוסף יש לנקוט כדי לבחור את התאים לכימות. בדרך כלל אנו מנתחים את התאים שקיבלו&gt; 90% נוזל הזרקה בגרעין, כפי שנבחנו על ידי חלוקת OG-dextran.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Injection buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>140 mM KCl and 10 mM HEPES, pH 7.4</td>
</tr>
<tr>
<td>Oregon Green 488-70kD Dextran</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D7173</td>
<td>Stock of 10mg/ml in injection buffer can be stored for longs periods of time at -80&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Borosilicate capillary tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>1B100F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gel loading pipette tips for loading injection needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>022351656</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>Eclipse Ti-S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige Group</td>
<td>NT-88-V3MSH</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe for injection</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>512311</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4</td>
</tr>
<tr>
<td>SSC Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.4</td>
</tr>
<tr>
<td>4% Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>15686</td>
<td>Stock of 37% Paraformaldehyde is diluted in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>0.1% Triton X-100 (Surfact-Amps)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>28314</td>
<td>Stock of 10% Triton X-100 is diluted in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Formamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fischer Scientific</td>
<td>F84-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran sulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fischer Scientific</td>
<td>BP1585-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E. coli tRNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>R1753</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vanadyl riboside complex (VRC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>R3380</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Whatman filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>28298-020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vibration control table</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kinetic Systems</td>
<td>5702E-3036-21</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluoromount G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Southern Biotech</td>
<td>0100-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&alpha;-amanitin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>A2263</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parafilm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-374-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vacuum Grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>695400008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T7 RNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>M0251S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly(A) Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hybridization Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>100mg/ml dextran sulfate, 5mM VRC, 150mM NaCl, 15mM sodium citrate, 0.5mg/ml E. coli tRNA, 60% formamide</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

analysis of mrna nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection

ב אאוקריוטים, RNA שליח (mRNA) הוא עיבד בגרעין והוא חייב להיות מיוצא לתוך הציטופלסמה לגשת מכונות תרגום. למרות הייצוא הגרעיני של ה-mRNA, נחקרה בהרחבה ב ביציות Xenopus 1 ואורגניזמים ממושמע גנטית כגון שמרים 2 וקו נגזר תסיסנית תא S2 3, מחקרים מעטים נערכו בתאי יונקים. יתר על קינטיקה של הייצוא ב mRNA יונקים תאים סומטיים יכול רק להסיק 4,5 בעקיפין. על מנת למדוד את הקינטיקה הייצוא הגרעיני של mRNA בתאי יונקים תרבות רקמות, פיתחנו assay המעסיקה את כוחו של microinjection יחד עם ניאון הכלאה באתרו (FISH). מבחני אלה היו בשימוש על מנת להוכיח כי בתאי יונקים, רוב mRNAs מיוצאים באופן שחבור תלוי 6,7, או באופן ספציפי הדורש רצפי הרנ&quot;א כגון האזור אות רצף קידוד (SSCR) 6. ב assay זה, התאים microinjected עם או במבחנה mRNA מסונתז או DNA פלסמיד המכיל את הגן של עניין. התאים microinjected מודגרת נקודות זמן שונות קבוע אז הלוקליזציה המשנה הסלולר של RNA הוא הוערכה באמצעות FISH. בניגוד transfection, שם השעתוק מתרחשת מספר שעות לאחר תוספת של חומצות גרעין, microinjection של ה-DNA או mRNA מאפשר ביטוי מהיר ומאפשר הדור של נתונים קינטית מדויקת.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection at JoVE.com

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

כאן אנו מתארים assay המעסיקה את כוחו של microinjection יחד עם ניאון<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה על מנת למדוד במדויק את הקינטיקה הייצוא הגרעיני של mRNA של יונקים תאים סומטיים.

אנליזה של קינטיקה mRNA גרעיני ייצוא בתאי יונקים ידי Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Microinjection Intranuclear של דנ&quot;א לתוך ניתק נוירונים היונקים למבוגרים

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Pulse-מרדף ניתוח של N-linked שרשראות סוכר מ גליקופרוטאינים בתאי יונקים

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

ניתוח תיקון DNA פעמיים גדיל Break (DSB) בתאי יונקים

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

הפעלה של אפופטוזיס על ידי Microinjection cytoplasmic של ציטוכרום ג</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

מדידת קינטיקה של שעתוק mRNA בתאים חיים יחיד

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

הערכת סלקטיבי mRNA התרגום בתאי יונקים ידי Polysome פרופיל

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

ניתוח Glucocorticoid צואה: לא פולשני ניטור הכליה ב Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...