Name: analysis of mrna nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection
Uploaded: 2010-12-04T13:00:00
Duration: 11 min 32 s
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हम ई. गोम्स के लिए उपयोगी सलाह और ए वाइल्ड के लिए हमें विभिन्न उपकरणों का उपयोग करने के लिए अनुमति देने के लिए धन्यवाद करना चाहते हैं. इस काम के स्वास्थ्य अनुसंधान (102,725 FRN) के लिए कनाडा संस्थान से एएफपी के लिए एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

<ol>
	<li>Luo, M. J., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+is+required+for+rapid+and+efficient+mRNA+export+in+metazoans.">Splicing is required for rapid and efficient mRNA export in metazoans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 14937-14942 (1999).</li><li>Bossie, M. A., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+of+macromolecules+between+the+cytoplasm+and+the+nucleus+in+yeast.">Movement of macromolecules between the cytoplasm and the nucleus in yeast.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 2, 768-774 (1992).</li><li>Farny, N. G., Hurt, J. A., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+global+and+transcript-specific+mRNA+export+pathways+in+metazoans.">Definition of global and transcript-specific mRNA export pathways in metazoans.</a> Genes Dev. 22, 66-78 (2008).</li><li>Audibert, A., Weil, D., Dautry, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+kinetics+of+mRNA+splicing+and+transport+in+mammalian+cells.">In vivo kinetics of mRNA splicing and transport in mammalian cells.</a> Mol. Cell. Biol. 22, 6706-6718 (2002).</li><li>Snaar, S. P., Verdijk, P., Tanke, H. J., Dirks, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+HCMV+immediate+early+mRNA+expression+in+stably+transfected+fibroblasts.">Kinetics of HCMV immediate early mRNA expression in stably transfected fibroblasts.</a> J. Cell. Sci. 115, 321-328 (2002).</li><li>Palazzo, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+signal+sequence+coding+region+promotes+nuclear+export+of+mRNA.">The signal sequence coding region promotes nuclear export of mRNA.</a> PLoS Biol. 5, e322-e322 (2007).</li><li>Valencia, P., Dias, A. P., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+promotes+rapid+and+efficient+mRNA+export+in+mammalian+cells.">Splicing promotes rapid and efficient mRNA export in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3386-3391 (2008).</li><li>Palazzo, A. F., Eng, C. H., Schlaepfer, D. D., Marcantonio, E. E., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+stabilization+of+microtubules+by+integrin-+and+FAK-facilitated+Rho+signaling.">Localized stabilization of microtubules by integrin- and FAK-facilitated Rho signaling.</a> Science. 303, 836-839 (2004).</li><li>Keller, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proper+alignment+of+the+microscope.">Proper alignment of the microscope.</a> Methods Cell Biol. 72, 45-55 (2003).</li><li>Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+chemical+modification+constraints+into+a+dynamic+programming+algorithm+for+prediction+of+RNA+secondary+structure.">Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7287-7292 (2004).</li><li>G&#246;rlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+signal+sequence+receptor+has+a+second+subunit+and+is+part+of+a+translocation+complex+in+the+endoplasmic+reticulum+as+probed+by+bifunctional+reagents.">The signal sequence receptor has a second subunit and is part of a translocation complex in the endoplasmic reticulum as probed by bifunctional reagents.</a> J. Cell Biol. 111, 2283-2294 (1990).</li><li>Perales, R., Bentley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Cotranscriptionality":+the+transcription+elongation+complex+as+a+nexus+for+nuclear+transactions.">"Cotranscriptionality": the transcription elongation complex as a nexus for nuclear transactions.</a> Mol. Cell. 36, 178-191 (2009).</li><li>Buratowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+through+the+RNA+polymerase+II+CTD+cycle.">Progression through the RNA polymerase II CTD cycle.</a> Mol. Cell. 36, 541-546 (2009).</li><li>Maniatis, T., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extensive+network+of+coupling+among+gene+expression+machines.">An extensive network of coupling among gene expression machines.</a> Nature. 416, 499-506 (2002).</li><li>Carter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+copy+number+estimation+using+a+mouse+whole-genome+oligonucleotide+microarray.">Transcript copy number estimation using a mouse whole-genome oligonucleotide microarray.</a> Genome Biol. 6, 61-61 (2005).</li></ol>

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Microinjection एक शक्तिशाली उपकरण है कि अलग सेलुलर प्रक्रियाओं के एक नंबर का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पारंपरिक सेल अभिकर्मक के विपरीत, microinjection शोधकर्ता प्रभावी रूप से एक बहुत ही संकीर्ण समय सीमा के भीतर सेलुलर नाभिक में न्यूक्लिक एसिड का परिचय देता है. एक परिणाम के रूप में, एक mRNA निर्यात, mRNA स्थानीयकरण, और प्रोटीन संश्लेषण की दर का निर्धारण करने के रूप में गतिज विश्लेषण प्रदर्शन कर सकते हैं. इसके अलावा, के बाद से प्रयोग की समय सीमा अपेक्षाकृत संक्षिप्त है, एक pleiotropic प्रभाव incurring के बिना कम समय spans भीतर विषाक्त यौगिकों कोशिकाओं को बेनकाब कर सकते हैं. इसके अलावा, निरोधात्मक या stimulatory यौगिकों, जैसे प्रमुख नकारात्मक प्रोटीन किया जा सकता है सह nucleic एसिड के साथ इंजेक्शन. अंत में, microinjections अभिकर्मक अभिकर्मकों, जो अक्सर कोशिकाओं को विषाक्त कर रहे हैं और अलग सेलुलर कार्यों उपद्रव हो सकता है के लिए आवश्यकता से बचने के. प्लास्मिड डीएनए इंजेक्शन बनाम mRNA पसंद इंजेक्षन करने के लिए न्यूक्लिक एसिड जिनमें से विचारों की एक संख्या पर निर्भर करेगा. प्लास्मिड डीएनए के इंजेक्शन के बाद, शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय न केवल mRNA synthesizes, लेकिन यह भी नवजात 12,13 प्रतिलेख प्रोटीन कारकों रंगरूटों. चूंकि इन कारकों mRNA प्रसंस्करण, परमाणु निर्यात और cytoplasmic स्थानीयकरण के रूप में इस तरह की घटनाओं को नियंत्रित, प्लास्मिड डीएनए इंजेक्शन का आकलन कैसे प्रतिलेखन बहाव प्रक्रियाओं के लिए युग्मित है के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि प्रतिलेखन परमाणु निर्यात 14 के लिए युग्मित किया जा सकता है, हमने पाया है कि इंजेक्शन mRNA थोड़ा की तुलना में vivo में लिखित 6 mRNA में तेजी से निर्यात किया जाता है. इस के लिए कारणों पल में स्पष्ट नहीं कर रहे हैं, लेकिन इस परिणाम सुझाव है कि हो सकता है कि के रूप में नए संश्लेषित mRNA शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय से उभर, यह है कि मंदबुद्धि परमाणु निर्यात परिसरों में बंधे हो सकता है. MRNA इंजेक्शन के साथ कुछ फायदे हैं. सबसे पहले, शोधकर्ता शाही सेना पोलीमरेज़ inhibitors का उपयोग नहीं है, करता है जो प्रभावित हो सकता है कि कैसे कोशिकाओं शाही सेना की समग्र चयापचय को विनियमित. दूसरे, शाही सेना के इन विट्रो में संशोधित किया जा सकता है इंजेक्शन के लिए पहले. उदाहरण के लिए, mRNAs विभिन्न 5 &#39;टोपी analogues या पाली (ए) पूंछ लंबाई के साथ संश्लेषित किया जा सकता है क्रम में आकलन के लिए कैसे इन सुविधाओं परमाणु 6 निर्यात प्रभावित है. तीसरा, शाही सेना की सटीक राशि अंतःक्षिप्त है कि मोटे तौर पर अनुमान लगाया जा सकता है. ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल के बाद, हम अनुमान है कि लगभग 20,000 से 50,000 अणुओं प्रत्येक नाभिक, जो अपेक्षाकृत छोटी है में इंजेक्ट कर रहे हैं जब एक ठेठ स्तनधारी सेल (400,000 के लिए 850.000 अणुओं) 15 में टेप की कुल संख्या की तुलना में. mRNA इंजेक्शन के साथ प्रमुख नुकसान यह है कि microinjection के दौरान, cytoplasm में इंजेक्शन द्रव की कुछ रिसाव अपरिहार्य है. Cytoplasm में सीधे इंजेक्शन mRNA के बाद से लंबी अवधि (ए Palazzo, अप्रकाशित अवलोकन) पर स्थिर है, अतिरिक्त देखभाल का चयन करने के लिए जो कोशिकाओं मात्रा निर्धारित कर रहे हैं लिया जाना चाहिए. आम तौर पर हम कोशिकाओं कि नाभिक के रूप में ओग dextran वितरण द्वारा मूल्यांकन&gt; इंजेक्शन तरल पदार्थ का 90% प्राप्त विश्लेषण.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Injection buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>140 mM KCl and 10 mM HEPES, pH 7.4</td>
</tr>
<tr>
<td>Oregon Green 488-70kD Dextran</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D7173</td>
<td>Stock of 10mg/ml in injection buffer can be stored for longs periods of time at -80&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Borosilicate capillary tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>1B100F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gel loading pipette tips for loading injection needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>022351656</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>Eclipse Ti-S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige Group</td>
<td>NT-88-V3MSH</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe for injection</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>512311</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4</td>
</tr>
<tr>
<td>SSC Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.4</td>
</tr>
<tr>
<td>4% Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>15686</td>
<td>Stock of 37% Paraformaldehyde is diluted in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>0.1% Triton X-100 (Surfact-Amps)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>28314</td>
<td>Stock of 10% Triton X-100 is diluted in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Formamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fischer Scientific</td>
<td>F84-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran sulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fischer Scientific</td>
<td>BP1585-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E. coli tRNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>R1753</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vanadyl riboside complex (VRC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>R3380</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Whatman filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>28298-020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vibration control table</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kinetic Systems</td>
<td>5702E-3036-21</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluoromount G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Southern Biotech</td>
<td>0100-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&alpha;-amanitin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>A2263</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parafilm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-374-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vacuum Grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>695400008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T7 RNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>M0251S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly(A) Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hybridization Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>100mg/ml dextran sulfate, 5mM VRC, 150mM NaCl, 15mM sodium citrate, 0.5mg/ml E. coli tRNA, 60% formamide</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

analysis of mrna nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection

Eukaryotes में, दूत शाही सेना (mRNA) के नाभिक में लिखित है और cytoplasm में निर्यात अनुवाद मशीनरी का उपयोग किया जाना चाहिए. हालांकि mRNA की परमाणु निर्यात Xenopus 1 oocytes और 2 खमीर और ड्रोसोफिला व्युत्पन्न S2 सेल लाइन 3 के रूप में आनुवंशिक विनयशील जीवों में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, कुछ अध्ययनों स्तनधारी कोशिकाओं में आयोजित किया गया था . इसके अलावा स्तनधारी दैहिक कोशिकाओं में mRNA निर्यात के कैनेटीक्स ही परोक्ष रूप से 4,5 inferred किया जा सकता है. आदेश में स्तनधारी टिशू कल्चर कोशिकाओं में mRNA की परमाणु निर्यात कैनेटीक्स को मापने के लिए, हम एक परख है कि microinjection स्वस्थानी संकरण (मछली) में फ्लोरोसेंट के साथ मिलकर की शक्ति को रोजगार विकसित किया है. ये assays कि स्तनधारी कोशिकाओं में mRNAs का बहुमत एक splicing निर्भर 6,7 तरीके में निर्यात कर रहे हैं, या तरह से है कि संकेत अनुक्रम कोडन क्षेत्र (SSCR) 6 के रूप में विशिष्ट शाही सेना दृश्यों की आवश्यकता है में प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस परख में, कोशिकाओं के साथ या तो इन विट्रो में संश्लेषित mRNA या प्लाज्मिड हित के जीन युक्त डीएनए microinjected हैं . microinjected कोशिकाओं विभिन्न समय फिर से तय की और शाही सेना के उप सेलुलर स्थानीयकरण मछली का उपयोग करने के लिए मूल्यांकन अंक के लिए incubated हैं. अभिकर्मक, जहां प्रतिलेखन nucleic एसिड के अलावा कई घंटे के बाद होता करने के लिए इसके विपरीत में, डीएनए या mRNA की microinjection तेजी से अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देता है और सटीक गतिज डेटा की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है.

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Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

यहाँ हम एक परख है कि microinjection फ्लोरोसेंट के साथ मिलकर की शक्ति को रोजगार का वर्णन<em&gt; बगल में</em&gt; संकरण क्रम में सही स्तनधारी दैहिक कोशिकाओं में mRNA की परमाणु निर्यात कैनेटीक्स उपाय.

MRNA परमाणु निर्यात कैनेटीक्स के Microinjection द्वारा स्तनधारी कोशिकाओं में विश्लेषण

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

Zebrafish भ्रूण में mRNA और morpholino antisense oligonucleotides Microinjection.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Dissociated वयस्क स्तनधारी न्यूरॉन्स में डीएनए की Intranuclear Microinjection

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

स्तनधारी कक्ष में glycoproteins से पल्स पीछा एन जुड़े चीनी चेन का विश्लेषण

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

स्तनधारी कोशिकाओं में डीएनए डबल कतरा तोड़ मरम्मत (DSB) के विश्लेषण

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagenesis और आयन चैनल के कार्यात्मक विश्लेषण Heterologously स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis साइटोक्रोम के cytoplasmic Microinjection द्वारा सक्रियकरण ग</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

एकल जीवित कोशिकाओं में mRNA ट्रांसक्रिप्शन के कैनेटीक्स माप

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

सेल चक्र स्थिति के स्तनधारी कोशिकाओं में विश्लेषण

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Polysome रूपरेखा द्वारा स्तनधारी कोशिकाओं में चयनात्मक mRNA के अनुवाद का आकलन

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

मलीय Glucocorticoid विश्लेषण: Equids में गैर-आक्रामक अधिवृक्क निगरानी

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...