Name: analysis of mrna nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection
Uploaded: 2010-12-04T13:00:00
Duration: 11 min 32 s
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私たちは、私たちは様々な機器を使用できるようにするための有用なアドバイスとA.ワイルドための大腸菌ゴメスを感謝したいと思います。この作品は、ヘルスリサーチ（FRN 102725）のためのカナダの協会からAFPへの助成金によって支えられている。

<ol>
	<li>Luo, M. J., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+is+required+for+rapid+and+efficient+mRNA+export+in+metazoans.">Splicing is required for rapid and efficient mRNA export in metazoans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 14937-14942 (1999).</li><li>Bossie, M. A., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+of+macromolecules+between+the+cytoplasm+and+the+nucleus+in+yeast.">Movement of macromolecules between the cytoplasm and the nucleus in yeast.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 2, 768-774 (1992).</li><li>Farny, N. G., Hurt, J. A., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+global+and+transcript-specific+mRNA+export+pathways+in+metazoans.">Definition of global and transcript-specific mRNA export pathways in metazoans.</a> Genes Dev. 22, 66-78 (2008).</li><li>Audibert, A., Weil, D., Dautry, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+kinetics+of+mRNA+splicing+and+transport+in+mammalian+cells.">In vivo kinetics of mRNA splicing and transport in mammalian cells.</a> Mol. Cell. Biol. 22, 6706-6718 (2002).</li><li>Snaar, S. P., Verdijk, P., Tanke, H. J., Dirks, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+HCMV+immediate+early+mRNA+expression+in+stably+transfected+fibroblasts.">Kinetics of HCMV immediate early mRNA expression in stably transfected fibroblasts.</a> J. Cell. Sci. 115, 321-328 (2002).</li><li>Palazzo, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+signal+sequence+coding+region+promotes+nuclear+export+of+mRNA.">The signal sequence coding region promotes nuclear export of mRNA.</a> PLoS Biol. 5, e322-e322 (2007).</li><li>Valencia, P., Dias, A. P., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+promotes+rapid+and+efficient+mRNA+export+in+mammalian+cells.">Splicing promotes rapid and efficient mRNA export in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3386-3391 (2008).</li><li>Palazzo, A. F., Eng, C. H., Schlaepfer, D. D., Marcantonio, E. E., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+stabilization+of+microtubules+by+integrin-+and+FAK-facilitated+Rho+signaling.">Localized stabilization of microtubules by integrin- and FAK-facilitated Rho signaling.</a> Science. 303, 836-839 (2004).</li><li>Keller, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proper+alignment+of+the+microscope.">Proper alignment of the microscope.</a> Methods Cell Biol. 72, 45-55 (2003).</li><li>Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+chemical+modification+constraints+into+a+dynamic+programming+algorithm+for+prediction+of+RNA+secondary+structure.">Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7287-7292 (2004).</li><li>G&#246;rlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+signal+sequence+receptor+has+a+second+subunit+and+is+part+of+a+translocation+complex+in+the+endoplasmic+reticulum+as+probed+by+bifunctional+reagents.">The signal sequence receptor has a second subunit and is part of a translocation complex in the endoplasmic reticulum as probed by bifunctional reagents.</a> J. Cell Biol. 111, 2283-2294 (1990).</li><li>Perales, R., Bentley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Cotranscriptionality":+the+transcription+elongation+complex+as+a+nexus+for+nuclear+transactions.">"Cotranscriptionality": the transcription elongation complex as a nexus for nuclear transactions.</a> Mol. Cell. 36, 178-191 (2009).</li><li>Buratowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+through+the+RNA+polymerase+II+CTD+cycle.">Progression through the RNA polymerase II CTD cycle.</a> Mol. Cell. 36, 541-546 (2009).</li><li>Maniatis, T., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extensive+network+of+coupling+among+gene+expression+machines.">An extensive network of coupling among gene expression machines.</a> Nature. 416, 499-506 (2002).</li><li>Carter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+copy+number+estimation+using+a+mouse+whole-genome+oligonucleotide+microarray.">Transcript copy number estimation using a mouse whole-genome oligonucleotide microarray.</a> Genome Biol. 6, 61-61 (2005).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

マイクロインジェクションは、さまざまな細胞プロセスの数を研究するために使用できる強力なツールです。従来の細胞のトランスフェクションとは異なり、マイクロインジェクションは、研究者が効果的に非常に狭い枠内の細胞核内に核酸を導入することができます。その結果、いずれかがこのようなmRNAの輸出、mRNAの局在化、およびタンパク質合成の速度を決定するなど、運動の解析を行うことができます。さらに、実験の期間は比較的短いですので、人は多面的な効果を招くことなく、短い時間のスパン内に毒性化合物に細胞を公開することができます。また、このようなドミナントネガティブ蛋白質などの阻害または刺激化合物は、核酸と共注入することができる。最後に、microinjectionsはしばしば細胞に有毒であると別の細胞機能を混乱させることができるトランスフェクション試薬のための要件を回避する。 プラスミドDNAの注射対発現核酸を注入するかは検討事項の数に依存します。プラスミドDNAの注入に続いて、RNAポリメラーゼIIは、mRNAを合成するだけでなく、新生転写物12,13にタンパク質因子を補充するだけ。これらの要因がこのようなmRNAプロセシング、核外輸送と細胞質局在などのイベントを管理するので、プラスミドDNAの注射は、転写が下流プロセスに結合されているかを評価するために使用することができます。転写は核輸出14に結合されるかもしれませんが、我々は、注入されたmRNAがわずかに速い生体転写されたmRNA 6 に比べて、エクスポートされていることを発見した。この理由は現時点では明確ではないが、この結果はとして、新たに合成されたmRNAはRNAポリメラーゼIIから出てくることを示唆していること、それはその遅延核外輸送複合体で提携することができます。 mRNAの注射といくつかの利点があります。最初に、研究者は細胞がRNAの全体的な代謝を調節する方法に影響を及ぼす可能性のある、RNAポリメラーゼ阻害剤を使用する必要はありません。第二に、RNAを注入する前に試験管内で変更することができます。例えば、mRNAがこれらの機能は、核輸出6をどのように影響するか評価するために様々な5&#39;キャップ類似体またはポリ（A）テールの長さで合成することができる。第三に、注入されるRNAの正確​​な量は大まかに推定することができる。上記のプロトコールに従って、我々は、約20,000〜50,000の分子と推定している典型的な哺乳類細胞（40〜85万分子）15の転写産物の総数に比べて比較的小さくなっている、それぞれの核に注入されています。 mRNAの注射との大きな欠点は、微量注入時に、細胞質に注入する液のいくつか漏れが避けられないということです。細胞質に直接注入mRNAは長時間（A.宮殿、未発表の観察）に渡って安定であるため、細心の注意は、細胞が定量化されている選択に注意する必要があります。一般的に我々は、OG -デキストランの分布によって評価、核内に注入流体の&gt; 90％を受け取った細胞を分析する。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Injection buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>140 mM KCl and 10 mM HEPES, pH 7.4</td>
</tr>
<tr>
<td>Oregon Green 488-70kD Dextran</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D7173</td>
<td>Stock of 10mg/ml in injection buffer can be stored for longs periods of time at -80&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Borosilicate capillary tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>1B100F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gel loading pipette tips for loading injection needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>022351656</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>Eclipse Ti-S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige Group</td>
<td>NT-88-V3MSH</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe for injection</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>512311</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4</td>
</tr>
<tr>
<td>SSC Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.4</td>
</tr>
<tr>
<td>4% Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>15686</td>
<td>Stock of 37% Paraformaldehyde is diluted in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>0.1% Triton X-100 (Surfact-Amps)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>28314</td>
<td>Stock of 10% Triton X-100 is diluted in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Formamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fischer Scientific</td>
<td>F84-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran sulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fischer Scientific</td>
<td>BP1585-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E. coli tRNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>R1753</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vanadyl riboside complex (VRC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>R3380</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Whatman filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>28298-020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vibration control table</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kinetic Systems</td>
<td>5702E-3036-21</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluoromount G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Southern Biotech</td>
<td>0100-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&alpha;-amanitin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>A2263</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parafilm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-374-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vacuum Grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>695400008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T7 RNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>M0251S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly(A) Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hybridization Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>100mg/ml dextran sulfate, 5mM VRC, 150mM NaCl, 15mM sodium citrate, 0.5mg/ml E. coli tRNA, 60% formamide</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

analysis of mrna nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection

真核生物では、メッセンジャーRNA（mRNA）が核内で転写され、翻訳機構にアクセスするために細胞質中にエクスポートする必要があります。 mRNAの核外輸送がアフリカツメガエルの卵母細胞 1、例えば酵母2、 ショウジョウバエ由来のS2細胞株3のような遺伝的に扱いやすい生物で広く研究されているが、いくつかの研究は、哺乳動物細胞中で実施されていた。さらに、哺乳類の体細胞におけるmRNA輸送の動態は、間接的に4,5推察される。哺乳類の組織培養細胞中のmRNAの核外輸送の速度を測定するために、我々はin situハイブリダイゼーション（FISH） の蛍光灯と相まってマイクロインジェクションの電源を採用してアッセイを開発した。これらのアッセイは、哺乳類細胞で、mRNAの大部分がスプライシング依存的に6,7にエクスポート、またはそのようなシグナル配列をコードする領域（SSCR）6のような特定のRNA配列を必要とするようにしていることを実証するために使用されている。このアッセイでは、細胞が合成されたmRNAまたは目的の遺伝子を含むプラスミドDNA をin vitroでのどちらかにマイクロインジェクションしている。マイクロインジェクション、細胞を固定し、RNAのサブ細胞内局在をFISHを用いて評価される様々な時点でインキュベートする。転写は、核酸の添加後数時間を発生するトランスフェクションとは対照的に、DNAまたはmRNAのマイクロインジェクションは、迅速な発現を可能にし、正確な運動データを生成することができます。

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Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

ここでは、蛍光と相まってマイクロインジェクションの電源を採用してアッセイを記述<em&gt;その場で</em正確に哺乳類体細胞におけるmRNAの核外輸送の速度を測定するために&gt;ハイブリダイゼーション。

マイクロインジェクションによる哺乳動物細胞におけるmRNA核外輸送の速度論の解析

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Research

JoVE Journal

Biology

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An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

解離成体哺乳類の神経細胞へのDNAの核内マイクロインジェクション

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Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

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Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

シトクロムの細胞質マイクロインジェクションによるアポトーシスの活性化 C</em

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Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

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ポリソームプロファイリングによる哺乳動物細胞における選択的mRNAの翻訳の評価

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