Name: analysis of mrna nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection
Uploaded: 2010-12-04T13:00:00
Duration: 11 min 32 s
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우리는 다양한 장비를 사용할 수 있도록 유용 조언과 A. 와일드에 대한 E.의 고메스 감사하고 싶습니다. 이 작품은 건강 연구 (FRN 102725)에 대한 캐나다 연구소에서 AFP에 부여에 의해 지원되었다.

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	<li>Luo, M. J., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+is+required+for+rapid+and+efficient+mRNA+export+in+metazoans.">Splicing is required for rapid and efficient mRNA export in metazoans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 14937-14942 (1999).</li><li>Bossie, M. A., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+of+macromolecules+between+the+cytoplasm+and+the+nucleus+in+yeast.">Movement of macromolecules between the cytoplasm and the nucleus in yeast.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 2, 768-774 (1992).</li><li>Farny, N. G., Hurt, J. A., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+global+and+transcript-specific+mRNA+export+pathways+in+metazoans.">Definition of global and transcript-specific mRNA export pathways in metazoans.</a> Genes Dev. 22, 66-78 (2008).</li><li>Audibert, A., Weil, D., Dautry, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+kinetics+of+mRNA+splicing+and+transport+in+mammalian+cells.">In vivo kinetics of mRNA splicing and transport in mammalian cells.</a> Mol. Cell. Biol. 22, 6706-6718 (2002).</li><li>Snaar, S. P., Verdijk, P., Tanke, H. J., Dirks, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+HCMV+immediate+early+mRNA+expression+in+stably+transfected+fibroblasts.">Kinetics of HCMV immediate early mRNA expression in stably transfected fibroblasts.</a> J. Cell. Sci. 115, 321-328 (2002).</li><li>Palazzo, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+signal+sequence+coding+region+promotes+nuclear+export+of+mRNA.">The signal sequence coding region promotes nuclear export of mRNA.</a> PLoS Biol. 5, e322-e322 (2007).</li><li>Valencia, P., Dias, A. P., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+promotes+rapid+and+efficient+mRNA+export+in+mammalian+cells.">Splicing promotes rapid and efficient mRNA export in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3386-3391 (2008).</li><li>Palazzo, A. F., Eng, C. H., Schlaepfer, D. D., Marcantonio, E. E., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+stabilization+of+microtubules+by+integrin-+and+FAK-facilitated+Rho+signaling.">Localized stabilization of microtubules by integrin- and FAK-facilitated Rho signaling.</a> Science. 303, 836-839 (2004).</li><li>Keller, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proper+alignment+of+the+microscope.">Proper alignment of the microscope.</a> Methods Cell Biol. 72, 45-55 (2003).</li><li>Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+chemical+modification+constraints+into+a+dynamic+programming+algorithm+for+prediction+of+RNA+secondary+structure.">Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7287-7292 (2004).</li><li>G&#246;rlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+signal+sequence+receptor+has+a+second+subunit+and+is+part+of+a+translocation+complex+in+the+endoplasmic+reticulum+as+probed+by+bifunctional+reagents.">The signal sequence receptor has a second subunit and is part of a translocation complex in the endoplasmic reticulum as probed by bifunctional reagents.</a> J. Cell Biol. 111, 2283-2294 (1990).</li><li>Perales, R., Bentley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Cotranscriptionality":+the+transcription+elongation+complex+as+a+nexus+for+nuclear+transactions.">"Cotranscriptionality": the transcription elongation complex as a nexus for nuclear transactions.</a> Mol. Cell. 36, 178-191 (2009).</li><li>Buratowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+through+the+RNA+polymerase+II+CTD+cycle.">Progression through the RNA polymerase II CTD cycle.</a> Mol. Cell. 36, 541-546 (2009).</li><li>Maniatis, T., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extensive+network+of+coupling+among+gene+expression+machines.">An extensive network of coupling among gene expression machines.</a> Nature. 416, 499-506 (2002).</li><li>Carter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+copy+number+estimation+using+a+mouse+whole-genome+oligonucleotide+microarray.">Transcript copy number estimation using a mouse whole-genome oligonucleotide microarray.</a> Genome Biol. 6, 61-61 (2005).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Microinjection 다른 세포 프로세스의 숫자를 연구하는 데 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 기존의 세포 transfection 달리, microinjection은 연구자가 효과적으로 매우 좁은 기간 내에 세포 핵에 핵산을 소개하실 수 있습니다. 그 결과, 하나는 mRNA 수출, mRNA의 현지화 및 단백질 합성의 속도를 결정하는 등 운동 분석을 수행할 수 있습니다. 또한, 실험의 기간은 비교적 짧은이기 때문에, 하나는 pleiotropic 효과를 발생하지 않고 짧은 시간에 걸쳐 내에 독성 화합물로 세포를 노출하실 수 있습니다. 또한, 그러한 지배 부정적인 단백질로 억제 또는 stimulatory 화합물은 핵산과 함께 공동 주입 수 있습니다. 마지막으로, microinjections은 종종 세포에 독성이 서로 다른 세포 기능을 교란 수 있습니다 transfection의 시약에 대한 요구 사항을 피할 수 있습니다. 플라스미드 DNA를 주사 대 mRNA 삽입하는 핵산은 고려의 숫자에 따라 달라집니다 중 선택할 수 있습니다. 플라스미드 DNA를 주사를 따라 RNA 중합 효소 II는 mRNA를 합성뿐만 아니라, 초기 사본 12,13에 단백질 요소를 모집뿐만 아니라. 이러한 요소는 이러한 mRNA 처리, 원자력 수출 및 세포질 현지화 같은 이벤트를 제어 때문에, 플라스미드 DNA를 주사는 전사가 하류 프로세스에 결합하는 방법 파악하기 위해 사용될 수 있습니다. 전사가 핵 수출 14 결합 수 있지만, 우리는 주입 mRNA가 약간 빠른 생체내 베꼈는데 mRNA 6 이상의 수출 것으로 나타났습니다. 이에 대한 이유가 지금 분명 아니지만,이 결과로 새로 합성된 mRNA는 RNA 중합 효소 II에서 나온다 것을 제안할 수 있습니다, 그것은 그 저능​​아 핵 수출 단지로 묶여있을 수 있습니다. mRNA 주사 몇 가지 이점이 있습니다. 첫째, 연구자는 세포가 RNA의 전반적인 신진 대사를 조절하는 방법에 영향을 미칠 수있는, RNA 효소 억제제를 사용할 필요가 없습니다. 둘째, RNA는 사출하기 전에 체외에서 수정할 수 있습니다. 예를 들어, mRNAs 이러한 기능이 핵 수출 6 미치는 영향 평가하기 위해 다양한 5 &#39;모자 analogues 또는 폴리 (A) 꼬리 길이와 합성 수 있습니다. 셋째, 주입 RNA의 정확한 금액은 대략 예상하실 수 있습니다. 위에서 설명한 프로토콜에 따라, 우리는 전형적인 포유 동물 세포 (400,000에 850,000 분자) 15 성적의 총 개수에 비해 약 20,000 50,000 분자가 비교적 작고 각 핵에 주입하는 예상하고있다. mRNA의 주사와 함께 가장 큰 단점은 microinjection 동안 세포질로 주입 유체의 일부 누수가 불가 피한 때문입니다. 세포질에 직접 주입 mRNA가 오랜 기간 (A. 집이되지 않은 관찰)을 통해 안정되기 때문에 별도의주의가 세포를 계량하는 선택로 이동합니다. 일반적으로 우리는 OG - dextran의 분포에 의해 평가 핵에 주입 유체의&gt; 90 %를받은 세포를 분석할 수 있습니다.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Injection buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>140 mM KCl and 10 mM HEPES, pH 7.4</td>
</tr>
<tr>
<td>Oregon Green 488-70kD Dextran</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D7173</td>
<td>Stock of 10mg/ml in injection buffer can be stored for longs periods of time at -80&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Borosilicate capillary tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>1B100F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gel loading pipette tips for loading injection needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>022351656</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>Eclipse Ti-S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige Group</td>
<td>NT-88-V3MSH</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe for injection</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>512311</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4</td>
</tr>
<tr>
<td>SSC Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.4</td>
</tr>
<tr>
<td>4% Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>15686</td>
<td>Stock of 37% Paraformaldehyde is diluted in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>0.1% Triton X-100 (Surfact-Amps)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>28314</td>
<td>Stock of 10% Triton X-100 is diluted in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Formamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fischer Scientific</td>
<td>F84-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran sulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fischer Scientific</td>
<td>BP1585-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E. coli tRNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>R1753</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vanadyl riboside complex (VRC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>R3380</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Whatman filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>28298-020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vibration control table</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kinetic Systems</td>
<td>5702E-3036-21</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluoromount G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Southern Biotech</td>
<td>0100-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&alpha;-amanitin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>A2263</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parafilm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-374-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vacuum Grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>695400008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T7 RNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>M0251S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly(A) Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hybridization Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>100mg/ml dextran sulfate, 5mM VRC, 150mM NaCl, 15mM sodium citrate, 0.5mg/ml E. coli tRNA, 60% formamide</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

analysis of mrna nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection

eukaryotes에서 메신저 RNA (mRNA)가 핵에 베꼈는데되고 번역 기계에 액세스하는 세포질에 수출해야합니다. mRNA의 핵 수출이 Xenopus oocytes의 1과 같은 효모 2 Drosophila S2 파생된 셀 3 호선으로 취급하기 쉬운 유전자 생물에서 널리 연구되어 있지만, 몇 가지 연구는 포유 동물 세포에서 실시했다. 또한 포유 동물 체세포의 mRNA 수출의 반응 속도론은 간접적으로 4,5 유추 수 있습니다. 포유 동물 조직 배양 세포에서 mRNA의 핵 수출 속도론을 평가하기 위해, 우리는 현장의 하이브리드화 (물고기)의 형광와 결합 microinjection의 전원을 고용 분석을 개발했습니다. 이러한 assays는 포유 동물 세포에 mRNAs의 대부분이 splicing에 의존하게 6,7으로 수출, 또는 신호 순서 코딩 영역 (SSCR) 6과 같은 특정 RNA의 시퀀스를 필요로하게됩니다 입증하는 데 사용되었습니다. 이 분석에서는, 세포는 mRNA 합성 또는 관심있는 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA와 중 체외에서 microinjected 있습니다. microinjected 세포 그런 다음 고정 및 RNA의 하위 세포 로컬 리 제이션이 물고기를 사용하여 평가됩니다 여러 시간 지점 incubated 수 있습니다. 전사는 핵산의 추가 후 몇 시간이 발생 transfection에 대조적으로, DNA 또는 mRNA의 microinjection은 빠르게 표현 가능하며 정확한 운동 데이터의 생성을 허용합니다.

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Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

여기 형광와 결합 microinjection의 전원을 고용 분석을 설명<em&gt; 현장에서</em정확하게 포유류의 체세포에서 mRNA의 핵 수출 속도론을 측정하기 위해&gt; 하이브 리다이 제이션.

Microinjection하여 포유 동물 세포에서 mRNA 원자력 수출 속도론 분석

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

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An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

연구

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Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Dissociated 성인 포유류의 뉴런으로 DNA의 Microinjection Intranuclear

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

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시토크롬의 세포질 Microinjection 의한 Apoptosis의 활성화 C</em

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Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

대변​​ 글루코 코르티코이드 분석 : equids는 비 침습적 부신 모니터링

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...