Name: assaying surface expression of chemosensory receptors in heterologous cells
Uploaded: 2011-02-23T17:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assaying Surface Expression of Chemosensory Receptors in Heterologous Cells at JoVE.com

Vi tackar ledamöterna Matsunami laboratorium för kritisk läsning av detta manuskript.

1. Förfarande: Proceduren består av tre delar genomfört över en total tid på 3 dagar: överföring av celler, transfektion och immuncytokemi, ett steg som utförs per dag. Överlåtelse och transfektion av celler under de första två dagarna skall utföras under sterila förhållanden i ett laminärt flöde kammare. Dag 1: Överföring av HEK293T celler för ytan uttryck analysen. <ol><li> Överföringsmedium (M10): Blanda minimiantal nödvändiga medel komp...

<ol>
	<li>Buck, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+multigene+family+may+encode+odorant+receptors:+a+molecular+basis+for+odor+recognition.">A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition.</a> Cell. 65, 175-187 (1991).</li><li>Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+receptor+codes+for+odors.">Combinatorial receptor codes for odors.</a> Cell. 96, 713-723 (1999).</li><li>Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RTP+family+members+induce+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors.">RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors.</a> Cell. 119, 679-691 (2004).</li><li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+cell-surface+expression+and+measuring+activation+of+mammalian+odorant+receptors+in+heterologous+cells.">Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells.</a> Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).</li></ol>

Varje steg måste utföras försiktigt för att säkerställa framträdande och särskiljande ytan färgning. Hela färgning processen måste utföras i kallt (på is), och facket som täckglas läggs måste kylas före användning för att säkerställa celler överleva. Dessutom fixering sker i slutet av ytan fläckar processen. Detta står i skarp kontrast med intern färgning där fixering före färgning till permeabilize cellmembranet till primära och sekundära antikroppar. Tiden för exponering av täckglas til...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cover slip 22 X 22 mm (#1)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>72200-11</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>16000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine 2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-019</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Minimal essential medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M4655</td>
<td>With L glutamate, Earle&#x2019;s salt and bicarbonate</td>
</tr>
<tr>
<td>Mowiol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>475904</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMS</td>
<td>19208</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1X </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco </td>
<td>14025</td>
<td>With calcium chloride and magnesium chloride</td>
</tr>
<tr>
<td>HEPES Buffer Solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>21-040-CV</td>
<td>Without calcium and magnesium</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly D Lysine Hydrobromide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7280</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Azide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EM Science</td>
<td>SX0299-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue culture dish 35 X 10 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>353801</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>25300</td>
<td>0.05%</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

assaying surface expression of chemosensory receptors in heterologous cells

Den levande värld av lukter är erkänd av känslan av luktsinne. Lukten i möss förmedlas av en repertoar av ca 1200 g Tillsammans proteinkopplade receptorer (GPCRs) 1 som postulerade att binda flyktiga doftämnen och omvandla den extracellulära signalen till en intracellulär signal genom koppling med G-protein Gαolf. Bindning av odörer till receptorer tros följa en kombinatorisk regel, det vill säga får en luktämnen binda flera receptorer och en receptor kan binda flera luktämnen i varierande grad 2. Biokemiska, signal-och ligandbindande studier har praktiskt genomförts för de flesta GPCRs med heterologt celler. Men användningen av heterolog celler för studier av luktreceptorer var utesluten för länge sedan på transfektion de misslyckades med att exportera till ytan. Saito et al har visat enda Receptor membranet passerar transporterande protein (RTP) familj följeslagare visar förbättrade uttryck i lukt sensoriska neuroner och agera som följeslagare till receptorer trafiken luktämnen till ytan i heterologa celler, vid samtidig transfekterade ihop 3. Att utföra biokemiska analyser för receptorer med heterologa celler, måste man först avgöra om receptorn uppvisar en robust yta uttryck i cellinje. Detta kan analyseras genom att överuttryck av receptorer med förkläde RTP1S följt av levande celler färgning till fluorescerande etikett den extracellulära domänen eller en tagg i den extracellulära domänen exklusivt. Här visar vi ett protokoll för att utföra levande cell färgning som kan användas för att upptäcka luktreceptorer på ytan av HEK293T celler bekvämt. Dessutom kan den också användas för att analysen för utanpåliggande uttryck av andra chemosensory receptorer eller GPCRs.

Watch this Scientific Journal Video about Assaying Surface Expression of Chemosensory Receptors in Heterologous Cells at JoVE.com

Assaying Surface Expression of Chemosensory Receptors in Heterologous Cells

Här visar vi ett protokoll för att utföra levande cell färgning som kan användas för att upptäcka luktreceptorer på ytan av HEK293T celler bekvämt. Dessutom kan den också användas för att analysen för utanpåliggande uttryck av andra chemosensory receptorer eller GPCRs.

Testmetoder Yta Redovisning av Chemosensory Receptorer i heterologa Cells

The vivid world of odors is recognized by the sense of olfaction. Olfaction in mice is mediated by a repertoire of about 1200 G Protein Coupled Receptors ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Testmetoder rörelseaktivitet att studera dygnsrytm och sömn Parametrar i Drosophila</em

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) ...

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Testmetoder motoriskt, inlärning och minne Brister i Drosophila Modeller för neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Ryggmärgen Elektrofysiologi II: Extracellulär Sug elektrod Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell imaging av sensoriska celler orgel Precursor i intakt Drosophila Puppor

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

Isolera Nasal Olfactory stamceller från gnagare eller människor

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Analys DNA-skador i hippocampus neuroner Använda Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Proprioception and Tension Receptors in Crab Limbs: Student Laboratory Exercises

Proprioception och Tension receptorer i Crab Limbs: Student Laborationer

The primary purpose of these procedures is to demonstrate for teaching and research purposes how to record the activity of living primary sensory neurons ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Induktion Plasticitet hos astrocytiska Receptorer genom manipulering av neuron priser

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Bestämning av cellytans uttryck och endocytisk hastighet för proteiner i primära astrocytkulturer med användning av biotinylering

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Identifiera cell ytan markörer av primära neurala stamceller och stamceller genom metabolisk märkning av Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...