Name: streamlined purification of plasmid dna from prokaryotic cultures
Uploaded: 2011-01-05T17:00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures at JoVE.com

1. Lysate التخليص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو E. ثقافات القولونية تحولت مع DNA البلازميد المطلوب في بئر عميقة لوحات (1 مل ​​من ثقافة / جيد) في مرق لوريا مع المضادات الحيوية المناسبة ليلا 37 درجة مئوية مع الهز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه كولاي في لوحة الثقافة في 5000 x ج لمدة 10 دقائق ، ثم طاف صب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend كل بيليه في 100 مخزن إعادة تعليق ميكرولتر (50 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0 ، 10 ملي EDTA ، 100 ميكروغرام / مل ريبونوكلياز A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 مخزن تحلل ميكرولتر / جيد (200 ملي هيدروكسيد الصوديوم ، SDS 1 ٪) ويهز باستخدام لوحة شاكر لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 العازلة تحييد ميكرولتر / جيد (3.0 خلات البوتاسيوم م ، ودرجة الحموضة 5.5) ويهز لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل lysate الخلية لوحة lysate التوضيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان لوحة الحمض النووي ملزمة لأعلى من 350 لوحة جمع ميكرولتر ومكان في الجزء السفلي من مشعب فراغ. مشعب تجميع فراغ (انظر الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة توضيح مكان lysate على رأس جهاز فراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق فراغ في 10 بوصة الزئبق (0.34 بار) وجمع الراشح في الحمض النووي لوحة ملزمة. لا تستخدم فراغ أكبر من 12 بوصة من الزئبق. (0.41 بار). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفكيك متعددة فراغ. 2 مل مكان النفايات لوحة جمع في الجزء السفلي من الجهاز. </li></ol> 2. الحمض النووي ملزم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل لوحة الحمض النووي ملزمة لأعلى متعددة (انظر الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 300 مخزن ميكرولتر / تجليد جيدا (6 M - الجوانيدين حمض الهيدروكلوريك) وماصة صعودا وهبوطا إلى المزيج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق فراغ [~ 5 بوصة زئبق (0.17 بار) للفراغ بطيئا] وتجاهل الترشيح. الحمض النووي هو الآن منضما إلى الغشاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مع 400 ميكرولتر / اغسل جيدا العازلة (80 ٪ إيثانول). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق فراغ ، ثم رفض الترشيح. تجاهل لا لزوم لها في حالة استخدام لوحة جمع 2 مل أو التصفية مباشرة إلى النفايات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار غسل مرة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لطخة أسفل لوحة تصفية على منشفة ماصة لتجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق فراغ مرة أخرى لمدة 5-10 دقائق لضمان إزالة بقايا الكحول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لطخة أسفل لضمان إزالة قطرات الايثانول. </li></ol> 3. شطف الحمض النووي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 70 العازلة شطف ميكرولتر / جيد (10 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0 ، 1 ملم EDTA). إذا كان المطلوب تركيز أعلى الحمض النووي ، يمكن تخفيض حجم إلى 50 ميكرولتر / جيد ، ولكن متوسط ​​العائد الكلي سيكون أقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن تنقية eluted الحمض النووي من قبل أي فراغ أو الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أسلوب فراغ : ضع لوحة جمع النظيفة (الدناز ، ريبونوكلياز مجانا) في مشعب فراغ. لوحة مكان تصفية على رأس مشعب الفراغ ، فراغ تنطبق على 15 بوصة من الزئبق (0.5 بار) لمدة 1 دقيقة حتى شطف جميع العازلة مرت لوحة الحمض النووي ملزمة. جمع الحمض النووي النقي (انظر الشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طريقة الطرد المركزي : ضع لوحة تنقية تصفية على أعلى لوحة النظيفة وجمع الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 5 دقائق. </li></ol> 4. الكمي والنوعي تحليلات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> OD قياس 260 / 280 ، وحساب تركيز تنقية الحمض النووي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل أداء agarose هلام من pDNA المنقى. </li></ol> 5. ممثل النتائج كولاي lysate توضيح باستخدام الطرد المركزي التقليدية وبول لوحات lysate مقدما توضيحا AcroPrep تصفية أظهرت انخفاض ملموس من الحطام من بدء المادية. (الشكل 4). وقد ارتفعت DNA البلازميد في ثلاثة تجمعات في TE العازلة ومرت عبر لوحة مقدما توضيحا AcroPrep lysate التصفية. مقارنة بين تركيز الحمض النووي البلازميد ، قبل وبعد الترشيح ، يظهر الانتعاش ~ 100 ٪ (الشكل 5) على جميع التركيزات الثلاثة. للتدليل على الانتعاش من الحمض النووي من توضيح E. وقد ارتفعت lysate القولونية ، DNA البلازميد في lysate الخام وأوضحت ثم عن طريق الترشيح. وأضيف على نفس الحمض النووي البلازميد الى خلية lysate الترشيح التالية. تم تنفيذ الكهربائي على aliquots من كل عينة (الشكل 6). واحد ، والفرقة واضحا من كثافة مماثلة من كل عينة يوضح وجدت القليل من فقدان الحمض النووي خلال الخطوة توضيح الترشيح مقرا لها. ثقافات E. وكانت تحتوي على الحمض النووي المنقى القولونية pCAT البلازميد من E. القولونية lysates به بال ال 350 مل و 1 ميكروليتر DNA لوحات تصفية ملزمة ، فضلا عن اثنين من الماركات الأخرى من 350 لوحات DNA ميكرولتر ملزمة. وأجريت جميع التنقيات على النحو المحدد في بروتوكول الشركة المصنعة الموصى بها. وينظر الى أعلى تركيز الحمض النووي والمحصول الكلي من بول في المقدمة AcroPrep 1 مل صفيحة تصفية تنقية الحمض النووي (الشكل 7 والجدول 2). على الرغم من أن المنافس W يظهر أيضا ارتفاع تركيز الحمض النووي (155 نانوغرام / ميكرولتر) ، ومجموع العائد الحمض النووي هو أدنى (4.7 ميكروغرام / أيضا) بسبب انخفاض حجم الانتعاش ، ~ 30 ميكرولتر. أعطى M منافس بأقل تركيز الحمض النووي في 108 نانوغرام / ميكرولتر مع تحقيق عائد إجمالي قدره 5.6 ميكروغرام / أيضا. آغارويظهر تحليل OSE هلام تنقية الحمض النووي pCAT من لوحات مختلفة three الحمض النووي الملزمة في الشكل 8. تم تعديل حجم العينة التي جمعت كل إلى 65 ميكرولتر لتصحيح الاختلافات في حجم الانتعاش قبل الكهربائي. تظهر supercoiled جميع عينات من الحمض النووي البلازميد ، ولكن يختلف العائد من الحمض النووي من كل من لوحات تصفية. ويبين الشكل 9 DNA أعد كل شيء في شكل supercoiled وتركيز مماثل. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. التجمع من فراغ المنوع استجلاء Lysate. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. التجمع من أجل ربط كهربائية المنوع الحمض النووي. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. التجمع من أجل شطف المنوع فراغ الفراغ. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. الترشيح يبسط توضيح العينة. عينات من ثلاث نسخ من 300 ميكرولتر من lysate الخام عن طريق الترشيح توضيح الفراغ (350 متقدم لوحة AcroPrep ميكرولتر lysate توضيح التصفية) أو الطرد المركزي التقليدي. OD 320 قياسها قبل وبعد التوضيح. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig5.jpg" alt="الشكل 5" /> الشكل 5. الاسترداد الكامل للpDNA بعد المرور عبر لوحة AcroPrep lysate المسبق تصفية التوضيح. 300 العازلة TE ميكرولتر ارتفعت مع pCAT في 50 و 25 و 100 ميكروغرام / مل. تركيز الحمض النووي والانتعاش المحسوبة من OD 260 قبل وبعد الترشيح ، 2 = ن. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig6.jpg" alt="الشكل 6" /> الشكل 6. الانتعاش من الحمض النووي pCAT بعد التوضيح. كميات متساوية من pUC19 ارتفعت الى lysate قبل أو بعد التوضيح ، المخفف ثم 1 إلى 10 في TE العازلة. تحميل 2 ميكرولتر / حارة على 1.2 ٪ Agarose هلام. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig7.jpg" alt="الشكل 7" /> الشكل 7. ارتفاع العائد DNA البلازميد بشكل جيد مع الحمض النووي لكل بظلالها Acroprep المسبق لوحة من لوحات تصفية ملزمة منافس. pCAT العائد DNA البلازميد (OD 260) باستخدام لوحات وأشار تنقية الحمض النووي مع 1 مل (بول والمنافس M) أو 1.5 مل (W المنافس) بين عشية وضحاها من الثقافة DH5α. تنقية باستخدام بروتوكول المصنعة للوحة الموصى بها. أشرطة الخطأ تشير إلى الخطأ المعياري (ن&gt; 6). <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig8.jpg" alt="الشكل 8" /> الشكل 8. Agarose هلام تحليل الحمض النووي pCAT تنقية الحمض النووي على لوحة تشير ملزمة. 1.2 agarose هلام الكهربائي ٪ من pDNA المنقى. تجميع عينات من ثلاث التنقيات منفصلة ، شطافة تعديلها إلى 65 ميكرولتر 1:10 بعد ، وتنقية المخفف. تحميل 2 ميكرولتر لكل حارة. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig9.jpg" alt="الشكل 9" /> الرقم 9. الجودة والانتعاش من الحمض النووي محض مماثل عندما تستخدم أجهزة الطرد المركزي أو فراغ أساليب جمع النهائي الكهربائي شطافة agarose هلام من pDNA المنقى. وأعقب البروتوكول أوصت الشركة المصنعة للحصول على سلفة AcroPrep تصفية لوحات لتنقية pDNA. تم تنفيذ شطف بواسطة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 5 دقائق أو 15 بوصة مع فراغ الزئبق (0.5 بار) لمدة 2 دقيقة.

الكتاب من هذه المادة عن طريق الفيديو والعاملين في علوم الحياة بال الذين ينتجون الصك والكواشف واردة في الفيديو والنص.

نحن وصف سطحي ، والبروتوكول مبسطة لوحات AcroPrep تصفية مسبقا أن يوفر العديد من المزايا. هذا الأسلوب يوفر أقصى غلة DNA البلازميد ، عندما يتم معالجتها في كتيب ، وشبه الآلي ، أو مؤتمتة بالكامل ، مقدما نماذج AcroPrep. وprefilter متكاملة عن لوحة إزالة lysate يقدم الترشيح ثابت من العينات ، وحتى تلك التي تحتوي على مستويات عالية من الجسيمات. هندسة جيدا لوحة النتائج في أسرع معدلات الترشيح عبر أكثر اتساقا مع حجم اللوحة اجراء متابعة الحد الأدنى ، وهندسة تلميح يوفر منفذا مباشرا لتدفق العينات في لوحة الاستقبال دون مخاوف من تلوث الصليب. الأهم من ذلك ، تم تحسين قدرات عالية غشاء ملزمة في الحمض النووي لوحة ملزمة للتقدم لوحات AcroPrep تصفية لاسترداد الحد الأقصى من الحمض النووي البلازميد ذات جودة عالية.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>AcroPrep Advance Filter plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PALL</td>
<td>PN 8175 (1 mL) or PN 8075 (350 &mu;l)</td>
<td>3 &mu;m glass fiber 0.2 &mu;m Supor&reg; membrane for clarification</td>
</tr>
<tr>
<td>AcroPrep Advance Filter Plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PALL</td>
<td>PN 8132</td>
<td>for DNA Binding</td>
</tr>
<tr>
<td>Vacuum manifold</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PALL</td>
<td>PN 5017</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vacuum pressure pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PALL</td>
<td>PN 13157</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

streamlined purification of plasmid dna from prokaryotic cultures

نحن تصف العملية الكاملة لتصفية AcroPrep المسبق لوحات لمدة 96 بلازميد التحضيرات ، بدءا من ثقافة بدائية وتنتهي مع الحمض النووي عالية النقاء. على أساس متعدد كذلك الترشيح لإزالة lysate البكتيرية وتنقية الحمض النووي ، وهذا الأسلوب يخلق عملية مبسطة لإعداد البلازميد. ويمكن بسهولة لوحات تحتوي على فلتر السيليكا وسائل الاعلام يمكن معالجتها عن طريق الترشيح أو الطرد المركزي للفراغ ينتج كميات ملحوظة من الحمض النووي البلازميد. تحاليل الحمض النووي تحديد كمية تنقية البلازميد هو دائما ذات جودة عالية مع متوسط ​​نسب 260/280 OD 1.97. عموما ، تقدم عوائد البلازميد الحمض النووي أكثر نقاء للتطبيقات المصب ، مثل الاستنساخ وتسلسلها. هذه طريقة مبسطة لاستخدام لوحات AcroPrep تصفية متقدم يسمح للتجهيز الخط ، وشبه الآلي أو مؤتمتة بالكامل.

Watch this Scientific Journal Video about Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures at JoVE.com

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

هذا البروتوكول هو بديل فعالة من حيث التكلفة لتوضيح موازية كفاءة وتنقية البلازميد الحمض النووي من<em&gt; E. القولونية</em&gt; الثقافات. عملية المسبق AcroPrep يبدأ مع لوحة lysate توضيح الأمثل فلتر تنقية تليها على ارتفاع صفيحة سعة ملزم الحمض النووي تصفية ملزمة.

تبسيط تنقية DNA البلازميد من ثقافات بروكاريوتيك

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...

Research

JoVE Journal

Biology

Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit

تنقية DNA البلازميد من المستعمرات البكتيرية باستخدام Miniprep Qiagen كيت

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial ...

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

التحول من الحمض النووي البلازميد في كولاي استخدام أسلوب الصدمة الحرارية

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

تنقية الميتوكوندريا من خلايا الخميرة

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

إنشاء الابتدائية الثقافات الليفية الكبار من القوارض

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

الخلية الأولية من الثقافات ذبابة الفاكهة الأجنة المعيدة

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

تنقية الأسلاف من الهيكل العظمي والعضلات

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

العزلة وتنقية كينيسين من ذبابة الفاكهة الأجنة

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

التنميط الجيني للعينات النباتية والحيوانية دون تنقية DNA قبل

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

الجيل الركيزة لEndonucleases من CRISPR / كاس أنظمة

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...