Name: streamlined purification of plasmid dna from prokaryotic cultures
Uploaded: 2011-01-05T17:00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures at JoVE.com

1. Лизат оформление <ol><li> Расти Е. кишечной культур трансформированных желаемого плазмидной ДНК в глубокий колодец пластин (1 мл культуры / лунку) в бульоне Лурия с соответствующими антибиотиками в течение ночи при 37 ° C при встряхивании. </li><li> Гранул кишечная палочка в культуре табличку на 5000 мкг в течение 10 минут, затем перелить супернатант. </li><li> Ресуспендируют каждая гранула в 100 мкл буфера ресуспендирования (50 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ ЭДТА, 100 мкг / мл РНКазы). </li><li> Добавить 100 мкл / лунку Лизис буфера (200 мМ NaOH, 1% SDS) и встряхните использовании планшетном шейкере в течение 2 минут. </li><li> Добавить 100 мкл / лунку Нейтрализация буфера (3,0 М ацетата калия, рН 5,5) и встряхивают в течение 2 минут. </li><li> Передача Клеточный лизат к лизат разъяснения пластины. </li><li> Место связывания ДНК пластины сверху 350 мкл пластины коллекцию и поместить в нижней части вакуумного многообразия. Сборка вакуумного многообразия (см. Рисунок 1). </li><li> Место лизат разъяснения пластину на верхней части вакуумного аппарата. </li><li> Применение вакуума при 10 дюймов Hg (0,34 бар) и сбор фильтрата в связывания ДНК пластины. Не используйте вакуум больше 12 дюймов рт. (0,41 бар). </li><li> Разберите вакуумного многообразия. Место 2 мл сбора отходов пластина в нижней части аппарата. </li></ol> 2. Связывание ДНК <ol><li> Перемещение связывания ДНК пластины в начало многообразии (см. Рисунок 2). </li><li> Добавить 300 мкл / лунку буфера для связывания (6 М гуанидин-HCl) и пипетка вверх и вниз, чтобы смешаться. </li><li> Применение вакуума [~ 5 дюймов Hg (0,17 бар) для медленных вакуум] и отбросить фильтрата. ДНК теперь связан с мембраной. </li><li> Промыть 400 мкл / лунку промывочного буфера (80% этанола). </li><li> Применение вакуума, затем удалите фильтрата. Удалите ненужные, если используются 2 мл коллекции плита или фильтрации непосредственно в отходы. </li><li> Повторите мыть один раз. </li><li> Пятно нижней части фильтра пластина на впитывающее полотенце для просушки. </li><li> Применение вакуумных еще раз в течение 5-10 минут, чтобы обеспечить удаление следов спирта. </li><li> Пятно снизу обеспечить удаление этанола капель. </li></ol> 3. ДНК Элюирование <ol><li> Добавить 70 мкл / лунку элюции буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА). Если выше концентрации ДНК желательно, объем может быть уменьшен до 50 мкл / лунку, но в среднем общий выход будет ниже. </li><li> Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение одной минуты. </li><li> Очищенная ДНК может быть элюировали либо вакуумом или центрифугирования. </li><li> Вакуумный метод: Поместите чистую тарелку коллекции (ДНКазы, РНКазы бесплатно) в вакуум многообразия. Место фильтр пластину на верхней части вакуумного многообразия, применять вакууме при 15 дюймов Hg (0,5 бар) в течение 1 минуты, пока все элюции буфера прошла через связывания ДНК пластины. Сбор очищенную ДНК (см. рисунок 3). </li><li> Центрифугирование Метод: Положите Фильтр для очистки пластины сверху чистую тарелку сбора и центрифуге при 1000 мкг в течение 5 минут. </li></ol> 4. Количественный и качественный анализ <ol><li> Мера OD 260/280, рассчитать концентрацию очищенной ДНК. </li><li> Выполните агарозном геле анализ очищенного плазмидной. </li></ol> 5. Представитель Результаты Кишечная палочка лизат уточнены с использованием традиционных центрифугирования и Pall AcroPrep Advance лизат разъяснения фильтра пластины показали заметное сокращение мусора из исходного материала. (Рис. 4). ДНК плазмиды в трех концентрациях шипами в ТЕ буфере и проходил через лизат AcroPrep Advance разъяснения фильтр пластины. Сравнение концентрации ДНК плазмиды, пре-и пост-фильтрации, показывает ~ 100% восстановления (рис. 5) на всех трех концентрациях. Чтобы продемонстрировать восстановление ДНК из уточнил Е. кишечной лизат, плазмиды ДНК шипами в сырой лизат, а затем уточнить путем фильтрации. Же ДНК плазмиды был добавлен в ячейке фильтрации следующие лизат. Электрофорез проводили на аликвоты из каждого образца (рис. 6). Единый, ясный полосы одинаковой интенсивности из каждого образца демонстрирует практически никакой ДНК потерь при фильтрации основе разъяснения шаг. Культуры E. кишечной содержащие рСаЬ плазмидной ДНК очищали от E. кишечной лизатов использованием 350 Полла мкл и 1 мл связывания ДНК фильтра плиты, а также два других марок 350 мкл связывания ДНК пластин. Все очищения были выполнены, как указано в протоколе рекомендуется производителем. Самая высокая концентрация ДНК и полный выход показаны с 1 Полла мл AcroPrep Advance ДНК Фильтр для очистки пластин (рис. 7 и таблицу 2). Хотя конкурентов W также показывает высокую концентрацию ДНК (155 нг / мкл), суммарный выход ДНК является самым низким (4,7 мкг / лунку) в связи с низким объемом восстановления, ~ 30 мкл. Конкурент М представил самую низкую концентрацию ДНК в 108 нг / мкл с общим выходом 5,6 мкг / лунку. АгарOSE гель анализ очищенного рСаЬ ДНК из трех различных связывания ДНК пластин показано на рисунке 8. Каждый собранный объем пробы доводили до 65 мкл для корректировки различий в восстановлении объема до электрофореза. Все образцы показывают суперспиральной плазмидной ДНК, но ДНК доходность от каждого из фильтровальных плит варьируется. На рисунке 9 показан подготовленный ДНК все в суперспиральной форме и имеет такие же концентрации. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. Ассамблея Вакуумный коллектор для лизат разъяснение. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig2.jpg" alt="Рисунок 2" /> Рисунок 2. Ассамблея Вакуумный коллектор для связывания ДНК. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig3.jpg" alt="Рисунок 3" /> Рисунок 3. Ассамблея Вакуумный коллектор для вакуумной элюции. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig4.jpg" alt="Рисунок 4" /> Рисунок 4. Фильтрация упрощает образец разъяснения. Triplicate образцы 300 мкл сырой лизат осветляли вакуумной фильтрации (350 мкл AcroPrep Advance лизат разъяснения фильтр пластины) или традиционным центрифугирования. OD 320 измеряется до и после разъяснения. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig5.jpg" alt="Рисунок 5" /> Рисунок 5. Полное восстановление плазмидной после прохождения AcroPrep Advance лизат пластины фильтра разъяснения. 300 мкл буфера TE подсыпали рСаЬ в 25, 50 и 100 мкг / мл. Концентрация ДНК и восстановления рассчитывается OD 260 до и после фильтрации, N = 2. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig6.jpg" alt="Рисунок 6" /> Рисунок 6. Восстановление рСаЬ ДНК после разъяснения. Равные количества pUC19 шипами в лизат до или после разъяснений, затем разбавляют 1 до 10 в буфере TE. Загружено 2 мкл / полосы на 1,2% агарозном геле. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig7.jpg" alt="Рисунок 7" /> Рисунок 7. Высшее плазмиды выход ДНК на лунку с покров Acroprep Advance связывания ДНК фильтр пластины, чем конкурент пластин. РСаЬ плазмиды выход ДНК (OD 260) с использованием указанных пластин очистки ДНК с 1 мл (Pall и Конкурент М) или 1,5 мл (Конкурент Вт) в течение ночи культуры DH5α. Очистка с использованием рекомендованных протокол пластины производителя. Ошибка полоски показывают стандартную ошибку (я&gt; 6). <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig8.jpg" alt="Рисунок 8" /> Рисунок 8. Агарозном геле анализ ДНК рСаЬ очищали на указанные связывания ДНК пластины. 1,2% агарозном гель-электрофорез очищенного плазмидной. Собранные пробы из трех отдельных очищения, элюата доводили до 65 мкл после очистки, разбавленный 1:10. Загружено 2 мкл на одну полосу движения. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig9.jpg" alt="Рисунок 9" /> Рисунок 9. Качество и восстановление чистой ДНК подобное, когда центрифуга или вакуумные методы используются для окончательного элюата коллекции агарозном гель-электрофорез очищенного плазмидной. Рекомендуется протокол производителя AcroPrep Advance Пластины фильтра последовали для очистки плазмидной ДНК. Элюирование исполнении центрифуге при 1000 мкг в течение 5 минут или вакуум с 15 дюймов Hg (0,5 бар) в течение 2 минут.

Авторы этого видео-статьи, сотрудники Pall Life Sciences, кто производит инструмент и реагенты в ролике и текст.

Мы описываем поверхностное, обтекаемый протокол пластин AcroPrep Advance фильтра, который предоставляет ряд преимуществ. Этот метод обеспечивает максимальную доходность плазмиды ДНК, когда обрабатывается в ручном, полуавтоматическом или полностью автоматизированных форматов AcroPrep Advance. Интегрированный фильтр предварительной очистки на лизат пластины клиренс обеспечивает постоянную фильтрацию образцы, даже те, с высоким содержанием твердых частиц. И геометрия пластины приводит к более быстрой, более равномерное скорости фильтрации через пластины с минимальным ограбления объем и геометрию выходе наконечник обеспечивает прямой поток образцов в приемнике пластиной без проблем перекрестного загрязнения. Важно отметить, что высокие обязательные мембраны потенциала связывания ДНК пластины AcroPrep Advance Пластины фильтра оптимизирована для максимального извлечения высококачественной плазмидной ДНК.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>AcroPrep Advance Filter plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PALL</td>
<td>PN 8175 (1 mL) or PN 8075 (350 &mu;l)</td>
<td>3 &mu;m glass fiber 0.2 &mu;m Supor&reg; membrane for clarification</td>
</tr>
<tr>
<td>AcroPrep Advance Filter Plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PALL</td>
<td>PN 8132</td>
<td>for DNA Binding</td>
</tr>
<tr>
<td>Vacuum manifold</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PALL</td>
<td>PN 5017</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vacuum pressure pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PALL</td>
<td>PN 13157</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

streamlined purification of plasmid dna from prokaryotic cultures

Мы опишем полный процесс AcroPrep Advance фильтра Плиты для 96 плазмиды препаратов, начиная от прокариотических культуры и заканчивая высокой чистоты ДНК. На основе нескольких хорошо фильтрации для бактериальной очистки лизата и очистки ДНК, этот метод создает упрощенный процесс с плазмидной ДНК. Фильтры чашек, содержащих кремний-СМИ может быть легко обработан вакуумной фильтрации или центрифуги для получения заметных количеств плазмидной ДНК. Количественный анализ определить очищенной ДНК плазмиды неизменно высокого качества со средним диаметром 260/280 отношение 1,97. В целом, плазмиды дает предлагают более чистой ДНК для последующих приложений, таких как секвенирование и клонирования. Этот обтекаемый метод использования AcroPrep Advance фильтра пластин позволяет для ручной, полуавтоматический или полностью автоматизированной обработки.

Watch this Scientific Journal Video about Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures at JoVE.com

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

Этот протокол представляет собой экономичную альтернативу для эффективных параллельных разъяснения и плазмиды очистки ДНК из<em&gt; Е. палочки</em&gt; Культур. Процесс AcroPrep Advance начинается с оптимизированным лизат разъяснения фильтр пластины с последующей очисткой на высокой связывающей способности связывания ДНК фильтр пластины.

Упрощенная очистка плазмидной ДНК из Прокариотические культур

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...

Research

JoVE Journal

Biology

Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit

Очищающий плазмидной ДНК из бактериальных колоний Использование Qiagen Miniprep Kit

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial ...

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Преобразование плазмидной ДНК в E.coli, с использованием метода теплового шока

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Окрашивание белков в гелях Кумасси G-250 без органических растворителей и уксусной кислоты

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Очистка Митохондрии из дрожжей Клетки

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

Создание первичных культурах фибробластов взрослых от грызунов

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Первичных клеточных культур из Drosophila Гаструла Эмбрионы

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Очистка прародителей из скелетных мышц

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Выделение и очистка от кинезин Drosophila Эмбрионы

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

Генотипирование растений и животных образцов без предварительного очистки ДНК

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

Субстрат поколения для эндонуклеаз CRISPR / Cas системы

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...