Name: streamlined purification of plasmid dna from prokaryotic cultures
Uploaded: 2011-01-05T17:00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures at JoVE.com

1. Lysat Utförsäljning <ol><li> Väx E. coli kulturer omvandlas med önskad plasmid-DNA i djupa brunnar (1 ml kultur / brunn) i Luria buljong med lämplig antibiotika över natten vid 37 ° C med skakning. </li><li> Pellets E. coli i kultur plattan vid 5000 xgi 10 minuter, sedan dekantera supernatanten. </li><li> Resuspendera varje pelleten i 100 mikroliter resuspension buffert (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 100 mikrogram / ml RNas A). </li><li> Tillsätt 100 mikroliter / brunn lyseringsbuffert (200 mM NaOH, 1% SDS) och skaka med platta shaker i 2 minuter. </li><li> Tillsätt 100 mikroliter / brunn Neutralization Buffer (3,0 m kaliumacetat, pH 5,5) och skaka i 2 minuter. </li><li> Överföring cell lysat att lysat förtydligande tallrik. </li><li> Placera DNA-bindande tallrik ovanpå 350 mikroliter samlingen plattan och lägg i botten av vakuum fördelare. Montera vakuum grenrör (se figur 1). </li><li> Placera lysat förtydligande tallrik ovanpå sugapparater. </li><li> Applicera vakuum vid 10 tum Hg (0,34 bar) och samla filtratet till DNA-bindande tallrik. Använd inte dammsugare är större än 12 tum Hg. (0,41 bar). </li><li> Demontera vakuum grenrör. Häll 2 ml avfallsinsamling plattan i botten av apparaten. </li></ol> 2. DNA-bindande <ol><li> Flytta DNA-bindande plattan till toppen av fördelaren (se figur 2). </li><li> Tillsätt 300 mikroliter / brunn Binding Buffer (6 M Guanidine-HCl) och pipettera upp och ner för att blanda. </li><li> Tillsätt vakuum [~ 5 tum Hg (0,17 bar) för långsam vakuum] och kasta filtratet. DNA är nu bundna till membran. </li><li> Tvätta med 400 mikroliter / brunn av tvättbuffert (80% etanol). </li><li> Tillsätt vakuum, sedan kasta filtratet. Kasta onödig om du använder 2 tallrik mL samling eller filtrering direkt till avfall. </li><li> Upprepa tvätta en gång. </li><li> Blot botten filterplattan på absorberande handduk för att torka. </li><li> Applicera vakuum gång i 5-10 minuter för att säkerställa borttagning av kvarvarande alkohol. </li><li> Blot botten för att säkerställa borttagning av etanol droppar. </li></ol> 3. DNA Elution <ol><li> Tillsätt 70 mikroliter / brunn Elution buffert (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA). Om högre DNA-koncentration önskas kan volymen reduceras till 50 ml / bra, men den genomsnittliga totala avkastningen blir lägre. </li><li> Inkubera plattan vid rumstemperatur i en minut. </li><li> Renat DNA kan elueras antingen vakuum eller centrifugering. </li><li> Vakuum metod: Placera rena samlingen platta (DNas, RNas gratis) i vakuum fördelare. Placera filtret tallrik ovanpå vakuum grenrör, tillämpa vakuum vid 15 tum Hg (0,5 bar) under 1 minut tills alla eluering buffert har passerat genom DNA-bindande plattan. Samla renade DNA (se figur 3). </li><li> Centrifugering metod: Sätt reningsfilter tallrik ovanpå rena samlingen plattan och centrifugera vid 1000 xg under 5 minuter. </li></ol> 4. Kvantitativa och kvalitativa analyser <ol><li> Mät OD 260/280, beräkna koncentrationen av renat DNA. </li><li> Utför agarosgel analys av det renade pDNA. </li></ol> 5. Representativa resultat E. coli lysat förtydligas med hjälp av traditionella centrifugering och Pall AcroPrep Advance lysat förtydligande filter Plattor visade märkbar minskning av skräp från utgångsmaterial. (Figur 4). Plasmid-DNA i tre koncentrationer var spetsade till TE-buffert och passerade genom AcroPrep Advance lysat förtydligande filter plattan. En jämförelse av plasmid-DNA-koncentration, före och efter filtrering, ~ visar 100% återvinning (Figur 5) på alla tre koncentrationer. För att demonstrera återvinning av DNA från förtydligas E. coli lysat, plasmid DNA spetsades till rå lysat och sedan klargöras genom filtrering. Samma plasmid-DNA inkom cell lysat efter filtrering. Elektrofores utfördes på alikvoter från varje prov (Figur 6). En enda, tydlig band av liknande intensitet från varje prov visar liten eller ingen DNA-förlust vid filtrering-baserade förtydligande steg. Kulturer av E. coli som innehåller pCAT plasmid-DNA har renats från E. coli lysates med Pall är 350 mikroliter och 1 ml DNA-bindande Filter Tallrikar, liksom två andra märken av 350 mikroliter DNA-bindande plattor. Alla reningar utfördes enligt tillverkarens rekommenderade protokoll. Den högsta DNA-koncentration och totalavkastning sett från Pall är 1 ml AcroPrep Advance DNA reningsfilter platta (Figur 7 och tabell 2). Även Konkurrent W visar också hög DNA-koncentration (155 ng / l), är den totala DNA ger den lägsta (4,7 mikrogram / brunn) på grund av den låga återställningsvolymen, ~ 30 mikroliter. Konkurrent M gav den lägsta koncentrationen av DNA vid 108 ng / mikroliter med en totalavkastning på 5,6 mikrogram / bra. AgarOSE gel analys av renat pCAT DNA från tre olika DNA-bindande plåtar visas i Figur 8. Varje samlas provvolymen justerades till 65 mikroliter för att korrigera för skillnader i återställningsvolymen innan elektrofores. Alla prover visar supercoiled plasmid-DNA, men DNA avkastningen från varje filter plattor varierar. Figur 9 visar preparerat DNA är alla i supercoiled form och har liknande koncentration. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Montering av Vacuum Manifold för lysat förtydligande. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. Montering av Vacuum Manifold för DNA-bindande. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig3.jpg" alt="Figur 3" /> Figur 3. Montering av Vacuum Manifold för vakuum eluering. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig4.jpg" alt="Figur 4" /> Figur 4. Filtrering förenklar prov förtydligande. Tre exemplar prover av 300 mikroliter på råolja lysat förtydligats genom vakuumfiltrering (350 mikroliter AcroPrep Advance lysat förtydligande filterplattan) eller traditionella centrifugering. OD 320 mätas före och efter förtydligande. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig5.jpg" alt="Figur 5" /> Figur 5. Fullständig återhämtning av pDNA efter passage genom AcroPrep Advance lysat förtydligande filter plattan. 300 mikroliter TE buffert tillsattes pCAT vid 25, 50 och 100 mikrogram / ml. DNA-koncentration och återhämtning beräknas utifrån OD 260 före och efter filtrering, N = 2. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig6.jpg" alt="Figur 6" /> Figur 6. Återvinning av pCAT DNA efter förtydligande. Lika mycket pUC19 spetsade till lysat före eller efter förtydligande, utspädd sedan 1 till 10 i TE buffert. Laddade 2 mikroliter / körfält på 1,2% agarosgel. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig7.jpg" alt="Figur 7" /> Figur 7. Högre plasmid-DNA avkastning per bra med pall Acroprep Advance DNA-bindande filterplattan än konkurrenten tallrikar. PCAT plasmid-DNA avkastning (OD 260) med hjälp av angivna plattor DNA-rening med 1 ml (Pall och Konkurrent M) eller 1,5 mL (Konkurrent W) över natten kultur DH5α. Rening med hjälp av plåt tillverkarens rekommenderade protokoll. Fel staplar anger standardfel (n&gt; 6). <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig8.jpg" alt="Figur 8" /> Figur 8. Agarosgel analys av pCAT DNA renas på visade DNA-bindande plattan. 1,2% agarosgelelektrofores av det renade pDNA. Samlingsprover från tre olika reningar, eluatet justeras till 65 mikroliter efter rening, utspädd 1:10. Laddade 2 mikroliter per bana. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig9.jpg" alt="Figur 9" /> Figur 9. Kvalitet och återvinning av rena DNA liknande när centrifug eller vakuum metoder används för slutlig eluatet samling agarosgelelektrofores av det renade pDNA. Tillverkarens rekommenderade protokoll för AcroPrep Advance Filter Plattor följdes för pDNA rening. Eluering utfördes av centrifugera vid 1000 xg under 5 minuter eller vakuum med 15 tum Hg (0,5 bar) i 2 minuter.

Författarna till denna video-artikeln är anställda av vetenskaper Pall Life som producerar instrument och reagenser som används i videon och text.

Vi beskriver en lättköpt, strömlinjeformad protokollet av AcroPrep Plates Advance filter som ger flera fördelar. Denna metod ger maximal plasmid-DNA ger då bearbetas i manuell, halvautomatisk eller helautomatiska format AcroPrep Advance. Ett integrerat förfilter på lysat avslut plattan ger konsekvent filtrering av prover, även de som innehåller höga halter av partiklar. Brunnen geometri av plattan leder till snabbare, mer enhetliga filtrationshastighet över hela plattan med minimal hold-up-volym, och utloppet spetsen geometri ger direkt flödet av prover till mottagare tallrik utan bekymmer korskontaminering. Viktigt är det höga bindningsförmåga membran i DNA-bindande tallrik AcroPrep Advance Filter Plattor optimerad för maximal återvinning av hög kvalitet plasmid-DNA.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>AcroPrep Advance Filter plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PALL</td>
<td>PN 8175 (1 mL) or PN 8075 (350 &mu;l)</td>
<td>3 &mu;m glass fiber 0.2 &mu;m Supor&reg; membrane for clarification</td>
</tr>
<tr>
<td>AcroPrep Advance Filter Plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PALL</td>
<td>PN 8132</td>
<td>for DNA Binding</td>
</tr>
<tr>
<td>Vacuum manifold</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PALL</td>
<td>PN 5017</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vacuum pressure pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PALL</td>
<td>PN 13157</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

streamlined purification of plasmid dna from prokaryotic cultures

Vi beskriver hela processen från AcroPrep Advance Filter Plattor för 96 plasmiden förberedelser, från prokaryota kultur och slutar med hög renhet DNA. Baserat på flera bra filtrering för bakteriell lysat clearance och DNA-rening, ger denna metod en strömlinjeformad process för plasmid beredning. Filtrera plattor som innehåller kvarts-baserade media kan lätt bearbetas av vakuum filtrering eller centrifugering för att ge betydande mängder av plasmid-DNA. Kvantitativa analyser bestämma renade plasmid-DNA är genomgående av hög kvalitet med genomsnittet OD 260/280 förhållandet mellan 1,97. Sammantaget plasmid ger erbjuda fler rena DNA för nedströms applikationer, såsom sekvensering och kloning. Denna förenklade metod att använda AcroPrep Advance Filter Plattor möjliggör manuell, halvautomatisk eller helt automatiserad.

Watch this Scientific Journal Video about Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures at JoVE.com

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

Detta protokoll är ett kostnadseffektivt alternativ för effektiv parallell klargöranden och plasmid-DNA rening från<em&gt; E. coli</em&gt; Kulturer. Den AcroPrep Advance börjar med en optimerad lysat förtydligande filterplattan följt av rening på en hög bindningsförmåga DNA-bindande filter plattan.

Strömlinjeformad Rening av Plasmid DNA från Prokaryota kulturer

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...

Research

JoVE Journal

Biology

Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit

Purifying Plasmid DNA från kolonier Använda Qiagen Miniprep Kit

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial ...

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Omvandling av Plasmid DNA i E. coli med metoden Heat Shock

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färgning av proteinerna i geler med Coomassie G-250 utan organiska lösningsmedel och ättiksyra

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Rening av mitokondrier från jästceller

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

Etablera primärkulturer Vuxen Fibroblast från gnagare

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Primära cellkulturer från Drosophila Gastrula Embryon

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Rening av stamceller från skelettmuskulatur

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolering och rening av kinesin från Drosophila Embryon

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

Genotypning av vegetabiliskt och animaliskt prover utan Prior DNA Rening

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

Substrat för skapandet endonukleaser av CRISPR / CAS Systems

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...