Name: streamlined purification of plasmid dna from prokaryotic cultures
Uploaded: 2011-01-05T17:00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures at JoVE.com

1. Lizat Gümrükleme <ol><li> E. büyütün Luria Broth 37 gecede uygun antibiyotik ile derin kuyu plakaları istenen plazmid DNA (kültür / iyi 1 ml) ° C sallayarak ile dönüştürdü coli kültürleri. </li><li> 10 dakika boyunca 5.000 xg&#39;de kültür plakası Pelet E. coli, sonra süzün süpernatant. </li><li> 100 mcL Tekrar Süspansiyonu Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA, 100 mikrogram / mL RNaz A) her pelletini tekrar. </li><li> 100 mcL / iyi Lizis Buffer (200 mM NaOH,% 1 SDS) ekleyin ve 2 dakika boyunca plaka çalkalayıcı kullanarak sallamak. </li><li> 100 kuyu / mcL Nötralizasyon Buffer (3.0 M potasyum asetat, pH 5.5) ekleyin ve 2 dakika çalkalanır. </li><li> Açıklama plaka lizat hücre lizat aktarın. </li><li> 350 mcL toplama plakası ve vakum manifoldunun altına yeri üstüne yerleştirin DNA bağlayıcı plaka. (Bkz. Şekil 1) vakum manifoldunun birleştirin. </li><li> Elektrikli cihazların üstüne yerleştirin lizat açıklama plakası. </li><li> 10 inç Hg (0,34 bar) vakum uygulayın ve DNA bağlayıcı plakasına süzüntü toplamak. Hg in 12 daha büyük vakum kullanmayın. (0.41 bar). </li><li> Vakum manifoldunun sökün. Aparat altına yerleştirin 2 mL atık toplama plakası. </li></ol> 2. DNA Bağlama <ol><li> (Bkz. Şekil 2) DNA bağlayıcı plaka manifoldunun üstüne taşıyın. </li><li> 300 mcL / iyi Bağlama Buffer (6 M Guanidin-HCl) ekleyin ve karıştırın ve aşağı yukarı pipetle. </li><li> Vakum uygulayın [~ Hg yavaş vakum inç 5 (0.17 çubuğu)] ve süzüntü atın. DNA membrana bağlı. </li><li> Yıkama Tamponu (80% Etanol) / iyi 400 mcL ile yıkayınız. </li><li> Vakum uygulayın, sonra süzüntü atın. 2 mL toplama plakası kullanılarak veya doğrudan atık filtreleme, gereksiz yere atın. </li><li> Tekrar bir kez yıkayın. </li><li> Leke alt kurumaya havluya filtre plaka. </li><li> Artık alkol kaldırılmasını sağlamak için 5-10 dakika bir kez daha vakum uygulayın. </li><li> Etanol damlacıkların kaldırılmasını sağlamak için alt kurutun. </li></ol> 3. DNA Elüsyon <ol><li> 70 kuyu / mcL Elüsyon Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA) ekleyin. Yüksek DNA konsantrasyonu isteniyorsa, hacim 50 mcL / iyi olabilir, ama ortalama toplam verim düşük olacaktır. </li><li> Plaka, bir dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Arıtılmış DNA ya vakum veya santrifüj tarafından yıkandı, olabilir. </li><li> Vakum yöntemi: Vakum manifoldu içine yerleştirin temiz toplama plakası (DNaz, RNaz ücretsiz). Tüm elüsyon tampon DNA bağlayıcı plaka geçti kadar vakum manifoldunun üstüne koyun filtre plakası, 15 inç Hg (0,5 bar) 1 dakika için vakum uygulamak. Saflaştırılmış DNA (bkz. Şekil 3) toplayın. </li><li> Santrifüj yöntemi: 5 dakika 1000 xg&#39;de temiz toplama plakası ve santrifüj üst üste yerleştirin arıtma filtre plakası. </li></ol> 4. Nicel ve Nitel Analiz <ol><li> OD 260/280 ölçün, saflaştırılmış DNA konsantrasyonu hesaplar. </li><li> Saflaştırılmış pDNA agaroz jel analizi gerçekleştirin. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar E. coli, malzeme başlayan enkaz kayda değer bir azalma gösterdi geleneksel santrifüj ve Pall AcroPrep Advance lizat açıklama Filtre Tabaklar kullanarak açıklık lizat . (Şekil 4). Üç konsantrasyonlarda Plazmid DNA TE tampon içine çivili ve AcroPrep Advance lizat açıklama filtre plakası üzerinden geçti. Plazmid DNA konsantrasyonunun karşılaştırılması, filtrasyon öncesi ve sonrası, gösteriler üç konsantrasyonlarda% 100 iyileşme (Şekil 5) ~. Açıklık E. DNA kurtarma göstermek için coli lizat, plazmid DNA ham lizat çivili ve daha sonra filtrasyon ile duruluğu . Aynı plazmid DNA, hücre lizat aşağıdaki filtreleme eklendi. Elektroforez her bir örnek (Şekil 6) hacimde yapıldı. Her numune benzer şiddette bir tek, net bant filtreleme tabanlı açıklama adımı sırasında biraz varsa DNA kaybı göstermektedir. Kültürler E. pCAT plazmid DNA içeren coli E. arınmış coli Pall Kullanıcı mcL 350 ve 1 ml DNA bağlayıcı Filtre Tabaklar, 350 mcL DNA bağlayıcı plakaların yanı sıra diğer iki marka lizatları. Üreticinin tavsiye ettiği protokolde belirtildiği gibi tüm arındırmalardan yapıldı. Yüksek DNA konsantrasyonu ve toplam verim Pall 1 ml AcroPrep Advance DNA arıtma filtresi plaka (Şekil 7 ve Tablo 2) görülür. Rakip W yüksek DNA konsantrasyonu (155 ng / ml) göstermesine rağmen, toplam DNA verimi (4.7 mikrogram / iyi) düşük kurtarma hacmi nedeniyle düşük olduğu, ~ 30 mcL. Rakip M 108 DNA düşük konsantrasyon verdi ng / toplam 5.6 mg / iyi bir verim ile mcL. Agarose jel üç farklı DNA bağlayıcı plakaları pCAT saflaştırılmış DNA analizi Şekil 8&#39;de gösterilmiştir. Her toplanan numune hacmi elektroforez önce kurtarma hacmi farklılıkları düzeltmek için 65 mcL ayarlandı. Tüm numuneler plazmid DNA supercoiled gösterir, ancak her Filtre Tabaklar DNA verimi değişir. Şekil 9 hazırlanan DNA supercoiled formu ve benzeri konsantrasyon gösterir. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Lizat netleştirilmesi için vakum Manifold Meclisi. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. DNA Ciltleme için vakum Manifold Meclisi. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Vakum Elüsyon için vakum Manifold Meclisi. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. Filtrasyon örnek açıklama kolaylaştırır. Vakum filtrasyonu (350 mcL AcroPrep Advance lizat açıklama filtre plakası) veya geleneksel santrifüj açıklık ham lizat 300 mcL üç nüsha örnekleri. OD 320 açıklama öncesi ve sonrası ölçülmüştür. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5. PDNA AcroPrep Advance lizat açıklama filtre plakası geçişi sonra tam iyileşme. 300 mcL TE tampon, 25, 50 ve 100 mikrogram / mL pCAT ile çivili. DNA konsantrasyonu ve kurtarma, K = 2 öncesi ve filtrasyon sonra OD 260 hesaplanmıştır. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> Şekil 6. Açıklama sonra pCAT DNA Kurtarma. Eşit miktarda, açıklama öncesinde veya sonrasında lizat içine çivili pUC19 sonra TE tamponunda 10 1 seyreltilmiş. % 1.2 agaroz jel üzerinde 2 mcL / şeritli yüklendi. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig7.jpg" alt="Şekil 7" /> Şekil 7. Pall Acroprep Advance DNA rakip plakalar daha bağlayıcı filtre plakası ile ortalama Yüksek plazmid DNA verim 1 ml (Pall ve Rakip M) veya 1.5 mL (Rakip W) bir gecede kültürü ile gösterilir DNA arıtma plakaları kullanılarak pCAT plazmid DNA verimi (OD 260) DH5α. Plaka üreticinin tavsiye protokolü kullanılarak saflaştırılması. Hata çubukları standart hata (n&gt; 6) işaret etmektedir. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig8.jpg" alt="Şekil 8" /> Şekil 8. PCAT DNA agaroz jel analizi belirtilen DNA bağlayıcı plaka saflaştırılmış. Saflaştırılmış pDNA% 1.2 agaroz jel elektroforezi. Örnekleri, üç ayrı arındırmalardan Pooled eluat arıtma, seyreltilmiş 01:10 sonra 65 mcL ayarlanır. Hat başına 2 mcL yüklendi. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig9.jpg" alt="Şekil 9" /> Şekil 9. Kalite ve santrifüj veya vakum yöntemleri saflaştırılmış pDNA son eluat toplama agaroz jel elektroforezi için kullanılan benzer saf dna kurtarma. PDNA arıtma AcroPrep Gelişmiş Filtre Tabaklar için üreticinin tavsiye ettiği protokol izledi. Elüsyon, 2 dakika için 15 inç Hg (0,5 bar) ile 5 dakika veya vakum 1000 xg&#39;de santrifüj tarafından yapıldı.

Bu video makalenin yazarları, video ve metin özellikli cihaz ve reaktiflerin üreten Pall Yaşam Bilimleri çalışanları.

Biz çeşitli avantajları tanıyor AcroPrep Advance Filtre Tabaklar facile, aerodinamik protokol açıklar. Bu yöntem, manuel, yarı otomatik veya tam otomatik AcroPrep Advance biçimlerde işlenmiş, maksimum plazmid DNA verim sağlar. Lizat açıklık plaka üzerinde entegre bir ön filtre örnekleri, hatta partikül bu içeren yüksek düzeyde tutarlı filtrasyon sağlar. , Daha hızlı, daha düzgün bir plaka üzerinde minimal tutma hacmi ile filtrasyon hızları plaka sonuçlarının iyi geometri ve çıkış uç geometrisi, çapraz kontaminasyon endişeleri olmaksızın alıcı plakasına doğrudan numune akışı sağlar. Önemlisi, AcroPrep Gelişmiş Filtre Tabaklar DNA bağlayıcı plaka yüksek bağlama kapasitesi membran yüksek kalite plazmid DNA maksimum kurtarma için optimize edilmiştir.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>AcroPrep Advance Filter plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PALL</td>
<td>PN 8175 (1 mL) or PN 8075 (350 &mu;l)</td>
<td>3 &mu;m glass fiber 0.2 &mu;m Supor&reg; membrane for clarification</td>
</tr>
<tr>
<td>AcroPrep Advance Filter Plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PALL</td>
<td>PN 8132</td>
<td>for DNA Binding</td>
</tr>
<tr>
<td>Vacuum manifold</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PALL</td>
<td>PN 5017</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vacuum pressure pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PALL</td>
<td>PN 13157</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

streamlined purification of plasmid dna from prokaryotic cultures

Biz prokaryotik kültürünün başlangıç ​​ve yüksek saflıkta DNA ile biten, 96 plazmid hazırlıkları için AcroPrep Gelişmiş Filtre Tabaklar süreci tanımlamak. Bakteriyel lizat açıklık ve DNA saflaştırma için çok iyi filtrasyon dayanarak, bu yöntem plazmid hazırlanması için akıcı bir süreç oluşturur. Silika-tabanlı medya içeren Filtre plakalar, vakum filtrasyon veya santrifüj plazmid DNA kayda değer miktarda verim kolayca işlenebilir. Nicel analiz saflaştırılmış plazmid DNA 1.97 ortalama OD 260/280 oranları ile yüksek kalitede sürekli olarak belirler. Genel olarak, sıralama ve klonlama gibi downstream uygulamalar için daha saf DNA plazmid verim sunuyoruz. Aerodinamik AcroPrep Gelişmiş Filtre Tabaklar kullanarak bu yöntem, manuel, yarı otomatik veya tam otomatik işleme sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures at JoVE.com

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

Bu protokol, verimli paralel açıklama ve plazmid DNA arıtma için uygun maliyetli bir alternatif<em&gt; E. coli</em&gt; Kültürler. AcroPrep Advance sürecinin yüksek bir bağlama kapasitesi DNA bağlayıcı filtre plakası arıtma ile optimize edilmiş bir lizat açıklama filtre plakası ile başlar.

Prokaryotik Kültürler itibaren Plazmid DNA Aerodinamik Arıtma

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...

Research

JoVE Journal

Biology

Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit

Plazmid DNA Qiagen Miniprep Kit kullanarak Bakteri kolonileri Arındırıcı

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial ...

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Isı Şoku Yöntemiyle E. coli içine Plazmid DNA Dönüşüm

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Maya hücreleri Mitokondri saflaştırılması

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

Kemirgenler itibaren İlköğretim Yetişkin Fibroblast Kültürleri kurulması

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Birincil Hücre Kültürleri Drosophila Gastrula Embriyolar

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

İskelet Kası progenitörlerin saflaştırılması

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Kinesin İzolasyonu ve Saflaştırılması gelen Drosophila Embriyolar

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

Önce DNA Saflaştırma olmadan Bitki ve Hayvan Örnekleri genotiplendirmesi

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

CRISPR / Cas Sistemleri Endonükleazlar için Substrat Üretimi

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...