Name: quantitative measurement of glut4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry
Uploaded: 2010-11-07T17:00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry at JoVE.com

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من السيدة كليفورد غراهام الابيض إلدر هبوا صندوق البحوث والمعاهد الوطنية للصحة (AR059838) لبناء القدرات ، من المعاهد الوطنية للصحة (AR052791 ، AR044387 - الأذربيجانية ، وNS063298) لLTT ، وكلية بايلور للطب الخلوي والخلية الأساسية الفرز بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (NCRR S10RR024574 ، NIAID AI036211 ، وP30CA125123 NCI). المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة نظر رسمية من المعاهد الوطنية للصحة.

1. خلية يلطخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير الخلايا. وينبغي أن تستخدم الخلايا في حين لا يزال بنشاط متزايد (60-80 التقاء ٪). مصل تجويع الخلايا بين عشية وضحاها ، وخلايا لوحة لهم عند 0.1 مليون برميل في المتوسط ​​0،5 جيدا في المصل خالية مل في صفيحة ال 24 جيدا ووضعه في الحاضنة (37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2) لمدة 30 دقيقة -- 2 ساعة لاسترداد من trypsinization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج الأجسام المضادة الابتدائية والثانوية. مزيج (5 ميكرولتر من الأجسام المضادة لمكافحة GLUT4 الأولية مع 1 ميكرولتر الضد الدجاج الثانوية مفتش مكافحة الماعز مترافق لAlexaFluor 488) x عدد الآبار. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المخزون 2X عمل الانسولين عن طريق تمييع في المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق مما إذا الخلايا انضمت أم لا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة بلطف 6 مزيج الأجسام المضادة ميكرولتر و0.5 مل من المخزون الخاص 2X عمل الانسولين في الآبار التي تحتوي على الخلايا. تجنب أي اضطراب في المتوسط. احتضان (37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2) لمدة 30 دقيقة ، في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 0.5 مل من برنامج تلفزيوني PFA + 1 ٪ على كل جانب ، دون أن تهتز الخلايا. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان لديك الخلايا انضمت إلى الآبار ، ورفع بلطف لهم رافع الخلية. نقل الخلايا (1 مجموع مل) في الأنابيب التي تناسب في تدفق عداد الكريات الخاص وأجهزة الطرد المركزي لخلايا بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل مرتين مع بيليه في برنامج تلفزيوني مل 1 و resuspend في برنامج تلفزيوني 0.4 مل + 1 ٪ PFA. عند هذه النقطة ، يمكن أن تكون ملفوفة في احباط الخلايا وتخزينها في الثلاجة (4-8 درجة مئوية) ، أو نقله إلى تدفق عداد الكريات للحصول على البيانات الفورية. </li></ol> 2. الحصول على البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجموعة بوابة واسعة حول الخلايا الحية في الجانب مبعثر (SSC) مقابل قدما مبعثر لوحة (FCS). استخدام أنبوب السلبية (خلايا لا تعامل مع الأنسولين أو الخلايا &quot;ملطخة&quot; مع عنصر تحكم isotype) لتعيين المعلمة FL1. تأكد الخاص بك هو ذروة تماما في لوحة ، وليس بقطع في الجانب السفلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على البيانات من ما لا يقل عن 10000 الخلايا في الأنبوب. </li></ol> 3. تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم بوابة حول الخلايا الحية في لوحة SSC FSC مباراة (الشكل 1A). رسم رسوم بيانية للكثافة مضان مقابل 488 AlexaFluor عدد الخلايا الحية داخل بوابة خلايا (1B الشكل). يمكنك تراكب رسوم بيانية تصور مختلف لاختلاف الكميات ولكن ل، وتحديد كثافة وسيطة يعني مضان لكل خلية السكان واستخدام هذه الأرقام لإجراء مقارنات الخاص (الشكل 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيع البيانات إلى القيمة التي تم الحصول عليها في غياب الأنسولين ، كما هو مبين في الأرقام و1C 1D. </li></ol> 4. ممثل النتائج في myoblasts معزولة عن فرد صحية (أي مقاومة الانسولين) ، الانسولين يؤدي الى إزفاء تعتمد على الجرعة من GLUT4 من السيتوبلازم إلى غشاء البلازما (الشكل 1 ، يسار). في المقابل ، لا تحفز الانسولين GLUT4 إزفاء إلى غشاء البلازما myoblasts عزلها من المريض مع مقاومة الانسولين (الشكل 1 ، يمين). <img src="/files/ftp_upload/2429/2429fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. مثال تجربة تلوين. وقد تم عزل Myoblasts من متبرع دون مقاومة الانسولين (يسار) ومن مريض مع مقاومة الانسولين (يمين) ألف ، SSC (مبعثر الجانب) مقابل FCS (مهاجم مبعثر) مؤامرة مع بوابة حول الخلايا الحية. باء ، في خلايا بوابات A ، ملطخة الأضداد ضد حاتمة GLUT4 الخارجية ، وترك unstimulated (الحمراء) أو حفز مع نانومتر 1 الانسولين (الأزرق) ، 10 نانومتر (البرتقال) ، أو 100 نيوتن متر (الخضراء). لوضوح الشكل ، وتبين لنا فقط البيانات دون و100 نانومتر مع الانسولين للخلايا مقاومة الانسولين. C ، متوسط ​​كثافة مضان (MFI) من رسوم بيانية تظهر في وباء طبيعية لمؤسسات التمويل الأصغر من الخلايا unstimulated اليسار (لا الانسولين). D ، قطع من البيانات من مؤسسات التمويل الأصغر تطبيع رسوم بيانية تظهر في B.

<ol>
	<li>Zhao, F. Q., Keating, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+properties+and+genomics+of+glucose+transporters.">Functional properties and genomics of glucose transporters.</a> Curr. Genomics. 8, 113-128 (2007).</li><li>Karnieli, E., Armoni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+the+insulin-responsive+glucose+transporter+GLUT4+gene:+from+physiology+to+pathology.">Transcriptional regulation of the insulin-responsive glucose transporter GLUT4 gene: from physiology to pathology.</a> Am. J. Endocrinol. Metab. 295, 38-45 (2008).</li><li>Graham, T. E., Kahn, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+alterations+of+glucose+transport+and+molecular+mechanisms+of+intertissue+communication+in+obesity+and+type+2+diabetes.">Tissue-specific alterations of glucose transport and molecular mechanisms of intertissue communication in obesity and type 2 diabetes.</a> Horm. Metab. Res. 39, 717-721 (2007).</li><li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity.">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J. Immunol. Methods. 294, 15-22 (2004).</li><li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutellingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labeled+Annexin+V.">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V.</a> J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).</li><li>Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+analysis+in+flow+cytometry:+the+future+just+started.">Data analysis in flow cytometry: the future just started.</a> Cytometry A. 77, 705-713 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

لقد أثبتنا تقنية سريعة لقياس إزفاء من GLUT4 من السيتوبلازم إلى غشاء البلازما من الخلايا التدفق الخلوي. وأعرب هو عابر فقط GLUT4 في غشاء الخلايا والبلازما هي endocytosed. منذ أضداد ملزمة تظل مرتبطة GLUT4 ، حتى خلال الإلتقام ، ويعطي إشارة مضان المبلغ الإجمالي للGLUT4 التي تعرضت في غشاء البلازما خلال فترة الحضانة للاختيار في وجود الانسولين. ويمكن أيضا أن تطبق هذه التقنية لدراسة إزفاء من البروتينات الأخرى من حجرة داخل الخلايا لغشاء البلازما ، وقدم جيدة الأضداد الموجهة إلى حاتمة الخارجية للبروتين من الفائدة المتاحة. على سبيل المثال ، يتم الآن فحص مشابهة تستخدم عادة لتقييم معدل تحبب الخلايا اللمفاوية التائية السامة القاتلة الطبيعية والخلايا الليمفاوية عن طريق قياس إزفاء من CD107a لغشاء البلازما من 4،5. يمكن أيضا أن إزفاء من فسفاتيديل من الجانب الداخلي للغشاء البلازما إلى الجانب الخارجي خلال موت الخلايا المبرمج أو نخر الخلية يمكن الكشف عنها بواسطة التدفق الخلوي ، وذلك باستخدام fluorophore المسمى Annexin الخامس 6. بالإضافة إلى سرعة في الفحص ، التدفق الخلوي يقدم ميزة تسمح للدراسة إزفاء البروتين إلى غشاء البلازما في الخلية المختلطة السكان. في الواقع ، يمكن للمرء أن يجمع بين تلطيخ لعلامات فرعية الخلايا والبروتين للاهتمام ، يليها الحصول على البيانات على تدفق عداد الكريات متعددة الليزر 7. كميات من الأجسام المضادة الواردة في الفقرة 1.2 من البروتوكول هي نقطة الانطلاق ، ونحن نوصي معايرة الأضداد الخاص بخلايا اهتمامك لتحديد الحد الأدنى من تركيز الأجسام المضادة التي تمنحك إشارة الأقصى. ومن شأن مجموعة انطلاق جيدة لجسم الإنسان الأولية لمكافحة GLUT4 استخدمناها هنا سيكون ميكرولتر 10-10 في أنبوب (أي الأضداد ميكروغرام 0،2-2 في الأنبوب) ، كل أنبوب لا تحتوي على أكثر من 1 مليون خلية. عن الأجسام المضادة الأولية الأخرى ، يرجى الرجوع إلى تعليمات المورد. تطبيع البيانات اللازمة كما تألق ذاتي للخلايا وسوف تختلف من مانح إلى آخر ومن تجربة إلى تجربة.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Anti-human GLUT4 antibodies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz Biotechnologies</td>
<td>sc-1606</td>
<td>Against an external epitope of GLUT4</td>
</tr>
<tr>
<td>Chicken anti-goat IgG conjugated to AlexaFluor 488</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A-21467</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Recombinant human insulin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>I2643</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell lifters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>29942-118</td>
<td>Cut to fit the wells</td>
</tr>
<tr>
<td>5 ml tubes for FACS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>60819-138</td>
<td>Fit all BD machines</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

quantitative measurement of glut4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry

الجلوكوز هو المصدر الرئيسي للطاقة في الجسم ، الأمر الذي يتطلب التنظيم المستمر لتركيز الدم والخمسين. الافراج عن الانسولين من البنكرياس يدفع امتصاص الغلوكوز من قبل الأنسجة الحساسة للأنسولين ، وعلى الأخص في الدماغ ، والعضلات والهيكل العظمي والخلايا الشحمية. المرضى الذين يعانون من مرض السكري نوع 2 و / أو السمنة غالبا ما تضع مقاومة الانسولين وغير قادرة على السيطرة على توازن الجلوكوز. وقد رؤى جديدة في آليات مقاومة الانسولين تقديم استراتيجيات جديدة لمعالجة مرض السكري من نوع 2. الأسرة تخمة من ناقلات الجلوكوز يتكون من ثلاثة عشر عضوا موزعة على الأنسجة المختلفة في جميع أنحاء الجسم 1. اكتب نقل الجلوكوز 4 (GLUT4) هو نقل الكبرى التي تتوسط امتصاص الأنسولين الجلوكوز الأنسجة الحساسة ، مثل العضلات والهيكل العظمي. عند الربط من الانسولين لمستقبله ، التي تحتوي على حويصلات GLUT4 نقل من مكان لآخر من السيتوبلازم إلى غشاء البلازما ، وحمل امتصاص الغلوكوز. انخفاض GLUT4 إزفاء هي واحدة من أسباب مقاومة الانسولين في مرض السكري من نوع 2 2،3. يمكن للإزفاء من GLUT4 من السيتوبلازم إلى غشاء البلازما التي يمكن تصور كيمياء سيتولوجية مناعية ، وذلك باستخدام fluorophore - مترافق GLUT4 محددة الأجسام المضادة. هنا ، نحن تصف تقنية لتحديد مجموع المبالغ من GLUT4 إزفاء إلى غشاء البلازما الخلايا خلال مدة المختار ، وذلك باستخدام التدفق الخلوي. هذا البروتوكول هو السريع (أقل من 4 ساعات ، بما في ذلك الحضانة مع الأنسولين) ويسمح تحليل بعض الخلايا مثل 3000 أو ما يصل إلى 1000000 في حالة الخلايا في تجربة واحدة. لأنه يعتمد على مكافحة GLUT4 الأجسام المضادة الموجهة إلى حاتمة الخارجية للنقل التي تربط إليها بأسرع ما يتعرض له المتوسط ​​خارج الخلية بعد إزفاء إلى غشاء البلازما.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry at JoVE.com

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

يصف هذا البروتوكول تقنية سريعة لقياس إزفاء من GLUT4 من السيتوبلازم إلى غشاء البلازما من الخلايا التدفق الخلوي.

قياس الكمي GLUT4 إزفاء إلى غشاء البلازما التي التدفق الخلوي

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

قياس معدلات بلازما بروتين الغشاء التقامي بواسطة Biotinylation عكسية

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

IP - FCM : مناعي التي كشفتها التدفق الخلوي

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

تدفق تنقية الخلوي للخلايا الفأر الانتصافي

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

رسم خرائط الانتشار الجزيئي في غشاء البلازما من قبل متعددة الهدف، للبحث عن المفقودين (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

الأمثل أساليب النمذجة وتلوين لرصد انتشار استخدام الأصباغ انقسام الخلية خلية تتبع

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

في الوقت الحقيقي تحليلات النقل الريتينول بواسطة مستقبلات البروتين غشاء البلازما الريتينول ملزم

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

مناعي للبروتينات الغشاء الخارجي بواسطة التدفق الخلوي من الميتوكوندريا المعزولة

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

التمايز كفاءة عالية من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان لالعضلية وتوصيف بواسطة التدفق الخلوي

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

قياس وقت واحد من الميتوكوندريا الكالسيوم والميتوكوندريا غشاء المحتملة في الخلايا الحية التي كتبها نيون الميكروسكوب

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

قياس اندوريدوبليكيشن بقياس التدفق الدرنات المعزولة بروتوبلاستس

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...