Name: slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus
Uploaded: 2011-02-15T18:00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus at JoVE.com

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مجلس البحوث الطبية السويدية (K2009 - 75SX - 21028-01 - 3 ، K2008 - 61X - 20700 - 01 - 3) ؛ FONCICYT 000000000091984 ؛ أسس Jeansson ، Söderström sjukhemmet Königska ، Lundqvist مارثا وسيجورد إلسا اوتش Goljes Minne ، والجمعية السويدية للطب SLS - 95151. مع التقدير والإمتنان أستاذ الجينات دال بلوك ، جامعة كاليفورنيا ، للتعليق على مخطوطة ثمينة. نشكر الدكتور مايكل اندانج والدكتور Johard هيلانة لحاصرات قنوات HCN ، والأستاذ عبد السيد Manira من أجل توفير المجهر الفيديو. الاعتبارات الأخلاقية : أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها ومعهد كارولينسكا &quot;في ستوكهولم Norra Djurförsöksetiska Nämnd&quot;. يتم تنفيذ جميع التجارب على الحيوانات مع نية للحد من أي إزعاج أو الضغط الممكنة للحيوان.

<ol>
	<li>Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suprachiasmatic+nucleus:+cell+autonomy+and+network+properties.">Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties.</a> Annu Rev Physiol. 72, 551-577 (2010).</li><li>Green, D. J., Gillette, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythm+of+firing+rate+recorded+from+single+cells+in+the+rat+suprachiasmatic+brain+slice.">Circadian rhythm of firing rate recorded from single cells in the rat suprachiasmatic brain slice.</a> Brain Res. 245, 198-200 (1982).</li><li>Shibata, S., Oomura, Y., Kita, H., Hattori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythmic+changes+of+neuronal+activity+in+the+suprachiasmatic+nucleus+of+the+rat+hypothalamic+slice.">Circadian rhythmic changes of neuronal activity in the suprachiasmatic nucleus of the rat hypothalamic slice.</a> Brain Res. 247, 154-158 (1982).</li><li>Groos, G., Hendriks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+in+electrical+discharge+of+rat+suprachiasmatic+neurones+recorded+in+vitro.">Circadian rhythms in electrical discharge of rat suprachiasmatic neurones recorded in vitro.</a> Neurosci Lett. 34, 283-288 (1982).</li><li>Moore, R. Y., Klein, D., Moore, R., Reppert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+suprachiasmatic+nucleus+and+the+circadian+timing+system.">The suprachiasmatic nucleus and the circadian timing system.</a> Suprachiasmatic nucleus--The mind's clock. , 13-15 (1991).</li><li>Pol, A. N. V. a. n. d. e. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypothalamic+suprachiasmatic+nucleus+of+rat:+intrinsic+anatomy.">The hypothalamic suprachiasmatic nucleus of rat: intrinsic anatomy.</a> J Comp Neurol. 191, 661-702 (1980).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Yamazaki, S., Numano, R., Abe, M., Hida, A., Takahashi, R., Ueda, M., Block, G. D., Sakaki, Y., Menaker, M., Tei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resetting+central+and+peripheral+circadian+oscillators+in+transgenic+rats.">Resetting central and peripheral circadian oscillators in transgenic rats.</a> Science. 288, 682-685 (2000).</li><li>Geusz, M. E., Fletcher, C., Block, G. D., Straume, M., Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Kay, S. A., RN, D. a. y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+monitoring+of+circadian+rhythms+in+c-fos+gene+expression+from+suprachiasmatic+nucleus+cultures.">Long-term monitoring of circadian rhythms in c-fos gene expression from suprachiasmatic nucleus cultures.</a> Curr Biol. 7, 758-766 (1997).</li><li>Ko, C. H., Buhr, E. D., Siepka, S. M., Hong, H. K., Oh, W. J., Yoo, O. J., Menaker, M., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PERIOD2::LUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues.">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 5339-5346 (2004).</li><li>Yamazaki, S., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+luminescence+reporting+of+circadian+gene+expression+in+mammals.">Real-time luminescence reporting of circadian gene expression in mammals.</a> Methods Enzymol. 393, 288-301 (2005).</li><li>Yoshikawa, T., Yamazaki, S., Menaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+preparation+time+on+phase+of+cultured+tissues+reveal+complexity+of+circadian+organization.">Effects of preparation time on phase of cultured tissues reveal complexity of circadian organization.</a> J Biol Rhythms. 20, 500-512 (2005).</li><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (1997).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The rat brain in stereotaxic coordinates. , (1998).</li><li>O'Neill, J. S., Maywood, E. S., Chesham, J. E., Takahashi, J. S., Hastings, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP-dependent+signaling+as+a+core+component+of+the+mammalian+circadian+pacemaker.">cAMP-dependent signaling as a core component of the mammalian circadian pacemaker.</a> Science. 320, 949-953 (2008).</li><li>Hughes, A. T., Guilding, C., Lennox, L., Samuels, R. E., McMahon, D. G., Piggins, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+altered+period1+expression+in+the+suprachiasmatic+nuclei+of+Vipr2-/-+mice.">Live imaging of altered period1 expression in the suprachiasmatic nuclei of Vipr2-/- mice.</a> J Neurochem. 106, 1646-1657 (2008).</li><li>Zhang, D. Q., Zhou, T., Ruan, G. X., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythm+of+Period1+clock+gene+expression+in+NOS+amacrine+cells+of+the+mouse+retina.">Circadian rhythm of Period1 clock gene expression in NOS amacrine cells of the mouse retina.</a> Brain Res. 1050, 101-109 (2005).</li><li>Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biological+clock+nucleus:+a+multiphasic+oscillator+network+regulated+by+light.">The biological clock nucleus: a multiphasic oscillator network regulated by light.</a> J Neurosci. 23, 8070-8076 (2003).</li><li>LeSauter, J., Yan, L., Vishnubhotla, B., Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G., Silver, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+short+half-life+GFP+mouse+model+for+analysis+of+suprachiasmatic+nucleus+organization.">A short half-life GFP mouse model for analysis of suprachiasmatic nucleus organization.</a> Brain Res. 964, 279-287 (2003).</li><li>Nakamura, W., Yamazaki, S., Takasu, N. N., Mishima, K., Block, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+response+of+Period+1+expression+within+the+suprachiasmatic+nucleus.">Differential response of Period 1 expression within the suprachiasmatic nucleus.</a> J Neurosci. 25, 5481-5487 (2005).</li><li>Davidson, A. J., Yamazaki, S., Arble, D. M., Menaker, M., Block, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resetting+of+central+and+peripheral+circadian+oscillators+in+aged+rats.">Resetting of central and peripheral circadian oscillators in aged rats.</a> Neurobiol Aging. 29, 471-477 (2008).</li><li>Croning, M. D., Haddad, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+brain+slice+chamber+designs+for+investigations+of+oxygen+deprivation+in+vitro.">Comparison of brain slice chamber designs for investigations of oxygen deprivation in vitro.</a> J Neurosci Methods. 81, 103-111 (1998).</li><li>Burgoon, P. W., Boulant, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-sensitive+properties+of+rat+suprachiasmatic+nucleus+neurons.">Temperature-sensitive properties of rat suprachiasmatic nucleus neurons.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 281, 706-715 (2001).</li><li>Nishide, S. Y., Honma, S., Honma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circadian+pacemaker+in+the+cultured+suprachiasmatic+nucleus+from+pup+mice+is+highly+sensitive+to+external+perturbation.">The circadian pacemaker in the cultured suprachiasmatic nucleus from pup mice is highly sensitive to external perturbation.</a> Eur J Neurosci. 27, 2686-2690 (2008).</li><li>Yoshikawa, T., Sellix, M., Pezuk, P., Menaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+the+ovarian+circadian+clock+is+regulated+by+gonadotropins.">Timing of the ovarian circadian clock is regulated by gonadotropins.</a> Endocrinology. 150, 4338-4347 (2009).</li><li>Kohn, R. A., Dunlap, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+the+buffering+capacity+of+bicarbonate+in+the+rumen+and+in+vitro.">Calculation of the buffering capacity of bicarbonate in the rumen and in vitro.</a> J Anim Sci. 76, 1702-1709 (1998).</li><li>Wilsbacher, L. D., Yamazaki, S., Herzog, E. D., Song, E. J., Radcliffe, L. A., Abe, M., Block, G., Spitznagel, E., Menaker, M., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photic+and+circadian+expression+of+luciferase+in+mPeriod1-luc+transgenic+mice+in+vivo.">Photic and circadian expression of luciferase in mPeriod1-luc transgenic mice in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 489-494 (2002).</li><li>Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence/luminescence+circadian+imaging+of+complex+tissues+at+single-cell+resolution.">Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution.</a> J Biol Rhythms. 25, 228-232 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

منافع ومساوئ التكنولوجيا مع مراسل luciferase على النقيض من الأساليب فيفو السابقين ، مثل RT - PCR ، التهجين في الموضع وصمة عار الغربية التي تتطلب أخذ عينات الأنسجة في العديد من النقاط الزمنية المختلفة (إعطاء القرار وقت انخفاض ساعات 2-4 عادة اعتمادا على وتيرة أخذ العينات) من أجل دراسة نهاري الاختلافات في التعبير عن الجينات والبروتينات ، والتكنولوجيا مراسل luciferase يسمح عالية الدقة (1-10 دقيقة) دراسات التذبذبات الإيقاعية لعدة أيام في إعداد نفسها. دراسات وهكذا ، يتم تصغير عدد الحيوانات المستخدمة ومفصلة للتأثيرات على مرحلة وفترة ممكنة الإيقاع ، والتي عادة لا يمكن استخدام تقنيات أخذ العينات التقليدية مع القرار مرة منخفضة. لكن ، على الرغم من قياسات السعة النسبية للإيقاع ممكنة ، ينبغي التأكيد على أن التكنولوجيا مراسل ليس الكمية وبالتالي لا يمكن استخدامها لقياس كميات من الجينات المتحولة أو البروتينات ترجمتها. يمكن بدء التسجيلات تحليل الأنسجة ومباشرة بعد زراعة ، وهي ميزة كبيرة لدراسة آثار مباشرة في الضغط الجزيئي للالحية ، في ضوء التحولات فيفو المرحلة التي يسببها إلخ الثقافة SCN عضوي النمط يسمح على المدى الطويل (أسابيع) التلاعب الدوائية من الدماغ الكبار الأنسجة التي تحتوي على شبكة سليمة متشابك نضجا والتكنولوجيا مراسل luciferase يسمح التسجيلات مستقرة لعدة أسابيع. وبالتالي ، فإن الأنسجة لا تحتاج إلى أن يكون الولدان بعد الولادة أو في وقت مبكر من أجل الحصول على ثقافات صحية ، وعلى النقيض من العلاجات الدوائية شريحة الحادة المزمنة يمكن أن يؤديها. على النقيض من البلازميد ، مراسل transfections في مزارع الخلايا ، والتي لا تؤدي إلى أي دمج الحمض النووي في الجينوم ، والمعدلة وراثيا luciferase الحيوانات النماذج (وكذلك transfections lenti الفيروسات) مواتية إذا تعديلات جينية هي التي يتعين دراستها. وينبغي في هذا السياق أيضا يمكن الإشارة إلى أن التصوير التلألؤ في الوقت الحاضر هو ممكن مع اتفاقية مكافحة التصحر كاميرات حساسة للغاية 11 ، والسماح التسجيلات حتى في الخلايا العصبية SCN واحدة (~ 60-10 ميكرون) ، وأنواع الخلايا الأخرى ، والتي تستخدمها المختبرات الكبرى تدرس ايقاعات كل يوم. أخيرا ، والمحققين عادة ما تستخدم عدة الإيقاعية رصد الجزيئي باستخدام التعبير للصحفيين الأخرى ، مثل البروتين في نيون الخضراء ، من أجل دراسة الجينات ساعة / التذبذبات بروتين 16-19. جوانب شريحة سمك يمكن تخفيض سمك الموصى بها هنا للشريحة SCN (200-300 ميكرون) ، أو زيادة الرغبة. ومع ذلك ، على الرغم من أن الأنسجة مسطحا على الغشاء بعد بضعة أيام في الثقافة ، فمن غير المستحسن أن تتجاوز 500 ميكرومتر من سمك شريحة قطع في البداية من أجل الحفاظ على سلامة النسيج 7. أرق شريحة من 100 ميكرون هو من الأسباب الميكانيكية والعملية من الصعب التعامل معها. لأن الأنسجة غير المتجانسة SCN سمك شريحة قد تؤثر على مرحلة من مراحل الانتاج إشارة luciferase ، لأن المناطق المختلفة داخل SCN (على سبيل المثال &quot;الأساسية&quot; في مقابل &quot;وهمية&quot; ، والمناطق الظهرية مقابل بطني) التأرجح مع مختلف مراحل 20 و تفاضلي إعادة مزامنة بعد مرحلة تحولات القرن 21. سمك شريحة يؤثر أيضا على خط الأساس لعدد فوتون منذ أكثر الأنسجة تنبعث منه أكبر عدد من الفوتونات. بهذه الطريقة قد اتساع الاهتزازات الجزيئية تتأثر بشكل غير مباشر على حجم ازدراع. لهذه الأسباب ، ينبغي أن تحكم والثقافات المعالجة تكون دائما من نفس السمك والحجم والتي تحتوي على نفس المنطقة من اللجنة الدائمة للتغذية من أجل التأرجح في المرحلة نفسها ، والسعة مع نفسه. نواة two من جانب واحد ، من ناحية أخرى ، تتأرجح في مرحلة مع بعضها البعض ومع سعة مماثلة طالما vibratome قطع أفقي وليس الزاوية (والتي هي بدورها تعتمد على أن الفصل بين قطع المخيخ ونصفي الكرة الأرضية هو عمودي على سطح الطاولة). قد محقق الذي يؤدي استزراع SCN التجربة أن الثقافات SCN لا تتذبذب في مرحلة مع بعضها البعض. ممارسة وتوحيد أسلوب التقطيع ، أي تقطع دائما على مستوى شرائح rostro - الذيلية نفس اللجنة الدائمة للتغذية ، وسوف تحسين النتيجة. خطوات حاسمة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> امدادات الاوكسجين أمر بالغ الأهمية. لأن الدماغ يتطلب الكثير من الأكسجين 22 ، إجراء تشريح يحتاج إلى أن تكون سريعة (وكلما 3،1-3،10 هو 5-6 دقائق ~ كلما كان ذلك أفضل من أجل الحفاظ على الأنسجة السليمة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اللجنة الفرعية للتغذية حساس للتغيرات في درجة الحرارة وتبادل المتوسط. اللجنة الفرعية للتغذية حساس درجة الحرارة والتغيرات في درجات الحرارة يمكن أن مرحلة التحول الكبير في تنظيم ضربات القلب ويسبب القطع التجريبية 23. إذا كان يتم تبادل متوسطة أو الحلول أو وأضاف خلال تجربة الجارية ، على سبيل المثال عند تطبيق المخدرات بعد بضعة أيام في الثقافة والمتوسطة أو محلولن يجب أن يكون مسبقا لحرارة 36-37 درجة مئوية (في نفس درجة حرارة في الغرفة) قبل الإضافة. في التجارب الدوائية التي تنطوي على تبادل المتوسطة ، فمن المهم دائما للعمل مع الخلية قبل مكيفة متوسطة الثقافة. إضافة / غسل خارجا مع الطازجة والمتوسطة يمكن أن تحول دون شروط ، المرحلة يحتمل الإيقاع SCN 24 الجزيئية فضلا عن غيرها من الثقافات نوع من الخلايا 25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متوسطة التكوين. من المهم أن الثقافة في نسيج الحموضة الصحيح والأسمولية. المتوسط ​​الجوية التخزين المؤقت يحتوي على كمية كبيرة من HEPES ، التي لديها القدرة العازلة الأمثل في نطاق 6،8-8،2 درجة الحموضة ومناسب أيضا لدرجة الحموضة التخزين المؤقت التغييرات التي قد تحدث نتيجة للتنفس الخلية. HEPES ، من ناحية أخرى ، أكثر حساسية لتغيرات درجة الحرارة مقارنة مع بيكربونات الصوديوم ، والتي يتم تضمينها في كميات صغيرة في المتوسط ​​الثقافة. بيكربونات الصوديوم لديها قدرة أكبر على التخزين المؤقت في الجزء الأسفل من الرقم الهيدروجيني (5،1-7،1) مجموعة 26 ، وبالتالي المناسبة في جو 2 CO. ومع ذلك ، زادت كميات من بيكربونات الصوديوم في الهواء المتوسطة التخزين المؤقت (DMEM 2902) يزيد بشكل ملحوظ والأسمولية لا يمكن إضافتها في وقت واحد دون تمييع المتوسط ​​، والتي تؤدي بدورها في تكوين غير صحيح من الأمينية الفيتامينات والأحماض والأيونات. نصيحة لإعداد المتوسط ​​: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يكون دقيقا وحذرا عند خلط المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الحلول الأسهم الطازجة فقط أو إذابة حديثا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة الأسمولية عالية جدا لا يستحق تمييع. وسوف أكثر من 5-6 ٪ ، المخفف المتوسط ​​المرجح عدم العمل. استخدام D - غلوكوز لزيادة الأسمولية إذا كانت منخفضة جدا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرحلة التحولات بسبب الوقت اللازم لإعداد وقت إعداد شريحة أمر بالغ الأهمية. يتم الحصول على الحد الأدنى من الصفر أو تأثير على المرحلة إذا تم تنفيذ الإجراء شريحة بين 6-12 ZT 12. يجب أن يتم تنفيذ جميع تشريح شريحة في المرحلة نفسها من الدورة النهارية أو الإيقاعية من أجل تقليل الخطأ بسبب التفاوت بين مرحلة التحضيرات. </li></ol> التعديلات الممكنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالكهربية SCN الحادة ، وتشريح لابد من تنفيذها مع رينغر (السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي ؛ ACSF) العازلة ، ومشبع بالأكسجين (95 ٪ O 2 ، 5 ٪ CO 2) ، قبل ان يبدأ تشريح. مزيد من الأوكسجين الاحتياجات التي يمكن ان تضاف باستمرار إلى المخزن المؤقت أثناء إجراء تشريح كامل ، حيث أن النشاط الكهربائي ومتشابك يعتمد مباشرة على امدادات الاوكسجين 22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن أيضا شرائح أفقية والسهمي تكون مستعدة بنجاح والمثقفين من العقدة. الكتاب لديهم خبرة في التسجيلات luciferase شرائح أفقية ، والتي وفقا لخبرتنا تعطي التذبذبات الإيقاعية مع انخفاض السعة بالمقارنة مع خفض الاكليلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اللجنة الفرعية للتغذية ما يقرب من 1 ملم طويلة rostro - caudally واستهدفت تقنية التقطيع وصفها هنا من أجل الحصول على مقطع SCN في المنطقة الوسطى. ومع ذلك ، يمكن الحصول على أكثر من مقطع واحد من SCN الماوس وأدمغة الفئران ، والسماح للتحقيق في التعبير الجيني / البروتين الإيقاعية في مستويات أكثر منقاري مقابل الذيلية للنواة SCN. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن أيضا الثقافات شريحة أصغر سنا من الحيوانات ، والجراء بعد الولادة أو حتى الأجنة ، ويكون مستعدا. يرجى ملاحظة أن الدماغ في جمجمة والجراء الصغار جدا وناعمة جدا وحساسة. بالإضافة إلى ذلك ، في العصب البصري هو رقيق وليس تطويره بالكامل. أخذ الحذر عند تشريح الدماغ من الجراء حتى لا تلف المنطقة SCN. على سبيل المثال ، لا يمكن الصغرى مقراض أدوات يمكن استخدامها لفتح الجمجمة من الجراء الماوس لأنها كبيرة جدا. مقص الغرامة تكفي لقطع الأنسجة الناعمة في الجراء الصغار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن أيضا تغطية تقنية الزجاج ثقافة تستند صفها هنا يمكن استخدامها لالتلألؤ الصورة باستخدام كاميرا CCD / EM - CCD ، وأيضا في الخلايا العصبية SCN واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المركزية الاخرى في مناطق الجهاز العصبي والأنسجة الطرفية من الجهاز PER2 المعدلة وراثيا : يمكن للحيوانات يمكن الحصول عليها بسهولة لوك ، مثقف وتحليلها من حيث التذبذبات الجزيئي ، كما PER2 : لوك التعبير لا تزال تتأرجح لعدة أيام أيضا في عدد من الأنسجة الأخرى أنواع الخلايا و 10. معظم هذه الأنسجة الطرفية ، على سبيل المثال الكبد ، لا تتطلب غشاء من أجل البقاء ولكن بدلا من ذلك المثقف استحم مباشرة في 11 المتوسط. يرجى ملاحظة أن مرحلة التحول بسبب sectioning ، زراعة وتبادل المتوسطة قد لا تتبع نفس المبادئ للجنة الدائمة. </li></ol> أهمية الماوس في الفئران المعدلة وراثيا وسلالات (mPER2 : لوك ؛ mPer1 لوك ​​8 ، 10 ، 27) luciferase يعكس نشاط انزيم البروتين أو الإيقاعات والتعبير الجيني يمكن تقييمها من خلال تسجيل تلألؤ بيولوجي. وتلألؤ بيولوجي luciferase المولدة يعطي إشارة ضعيفة ولكن التألق خلفية قريبة من الصفر ، مما يجعل هذه الطريقة مفيدة. وعلاوة على ذلك ، لأن جزيء luciferase غير مستقرة تتحلل بسرعة وليس هناك فتاهتسميم أذني ، والتي يمكن أن تظهر خلال فترة طويلة الأجل إنارة مثير 28. أخذت معا ، هذه الخصائص تسمح للتجارب طويلة الأمد مما يجعل هذه التكنولوجيا مراسل luciferase مفيدا للغاية في مجال البحوث الإيقاعية.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>B27 supplement 50x</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover glasses</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Menzel-Gl&auml;ser</td>
<td>40#1</td>
<td>&#8776; 40 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Culture membranes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>PICMORG50</td>
<td>0.4 &mu;m</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM low glucose w/o phenol red</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D2902</td>
<td>Powder for 1L</td>
</tr>
<tr>
<td>Filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>1003 055</td>
<td>&#8776; 55 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Filtration set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>431097</td>
<td>Pore size 0.22 &mu;m
Polyethersulfone</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Allgaier Instrumente</td>
<td>0203-7-PS</td>
<td>Dumant #7</td>
</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>15630-056</td>
<td>100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>HBSS 10x</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco </td>
<td>14065-049</td>
<td>500 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>NaOCH3 7.5%</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>25080-060</td>
<td>50 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Luciferin </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>E1602</td>
<td>Beetle luciferin, potassium salt</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro rongeur tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Allgaier Instrumente</td>
<td>332-097-140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PenStrep 10,000 U/ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430165</td>
<td>&#8776; 35 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>PMT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>H9319-11MOD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Disposable scalpels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Paragon</td>
<td>P503</td>
<td>Size 11</td>
</tr>
<tr>
<td>Vacuum filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher </td>
<td>09-761-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vacuum grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>50 g</td>
</tr>
<tr>
<td>Vibratome</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Campden Instruments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus

مركزية الإيقاعية (~ 24 ساعة) على مدار الساعة يوميا في تنسيق إيقاعات الفيزيولوجيا والسلوك يكمن في التأقلم النواة (SCN) وتقع في منطقة ما تحت المهاد الأمامي. مزامنة مباشرة على مدار الساعة من الضوء عبر شبكية العين والعصب البصري. تتولد من خلال التفاعل اليومي التذبذبات حلقات ردود فعل سلبية من عدد من ما يسمى &quot;جينات الساعة&quot; ومنتجات البروتين ، بما في ذلك الفترة (لكل) الجينات. الساعة الأساسية هي أيضا تعتمد على الاستقطاب الغشاء ، والكالسيوم ومخيم 1. اللجنة الفرعية للتغذية ويبين التذبذبات اليومية في التعبير الجيني على مدار الساعة ، والنشاط الأيضي والنشاط الكهربائي التلقائي. بشكل ملحوظ ، وهذا النشاط لا يزال مستمرا في دوري الذاتية شرائح أنسجة البالغين من العقدة 2-4. بهذه الطريقة ، يمكن بسهولة على مدار الساعة البيولوجية دراستها في المختبر ، مما يسمح للتحقيقات الجزيئية ، والكهربية والأيضية وظيفة جهاز تنظيم ضربات القلب. اللجنة الفرعية للتغذية هو صغير ، واضحة المعالم بنية ثنائية الحق يقع فوق chiasm البصرية 5. في الفئران أنه يحتوي على خلايا عصبية ~ 8.000 في كل نواة ، ولها أبعاد ما يقرب من 947 ميكرومتر (الطول ، محور rostrocaudal) × 424 ميكرومتر (عرض) × 390 ميكرون (الارتفاع) 6. تشريح خارج SCN فمن الضروري خفض شريحة الدماغ على مستوى معين من الدماغ حيث يمكن التعرف على اللجنة الفرعية للتغذية. هنا ، نحن تصف الإجراء تشريح وتقطيع اللجنة الدائمة للتغذية ، الذي يشبه الفأر ولأدمغة الفئران. كذلك ، وتبين لنا كيف أن الثقافة تشريح الأنسجة organotypically على غشاء 7 ، وضعت لتقنية زراعة الأنسجة SCN بواسطة يامازاكي وآخرون 8. أخيرا ، علينا أن نظهر كيف يمكن استخدام أنسجة معدلة وراثيا لقياس التعبير عن الجينات ساعة / البروتينات باستخدام التكنولوجيا الحيوية مراسل luciferase ، وهو الأسلوب الذي كان في الأصل يستخدم لقياس الإيقاعية التي Geusz آخرون 9. نستخدم هنا الأنسجة SCN المعدلة وراثيا من المغلوب في PERIOD2 : LUCIFERASE الفئران التي تنتجها يو 10 آخرون. الفئران تحتوي على البروتين الانصهار الفترة (PER) (2) والانزيم LUCIFERASE يراعة. عندما تتم ترجمة PER2 في حضور الركيزة لluciferase ، أي luciferin ، يمكن رصدها على النحو PER2 التعبير عندما luciferase تلألؤ بيولوجي يحفز أكسدة luciferin. عدد الفوتونات المنبعثة يرتبط بشكل إيجابي في كمية البروتين PER2 المنتجة ، وعلى ايقاعات تلألؤ بيولوجي ايقاع المباراة PER2 البروتين في الجسم الحي 10. ويمكن بهذه الطريقة يكون الاختلاف في التعبير دوري PER2 رصد مستمر في الوقت الحقيقي خلال عدة أيام. وقد بروتوكول نتبع لزراعة الأنسجة وتسجيل الوقت الحقيقي تلألؤ بيولوجي صفها بدقة من قبل يامازاكي وتاكاهاشي 11.

Watch this Scientific Journal Video about Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus at JoVE.com

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

وذكرت وإجراءات إعداد شرائح تحتوي على الكبار الماوس طائي التأقلم النواة (SCN) ، وسيلة سريعة للثقافة نسيج العقدة في حالة الثقافة عضوي النمط. علاوة على ذلك ، وصفت قياس متذبذبة على مدار الساعة التعبير الجيني البروتين الحيوي باستخدام التكنولوجيا مراسل luciferase.

إعداد شريحة ، التثقيف الأنسجة وتسجيل Luciferase عضوي النمط من النشاط الجيني في نواة ساعة التأقلم

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

وعضوي النمط الثقافة شريحة الحصين النموذجي لفحص الإصابات متعلق بالخلايا العصبية

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

عضوي النمط الثقافات شريحة الحصين

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

تسجيل خلية كاملة من إعداد عضوي النمط شريحة من القشرة المخية الحديثة

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

التصوير فرمون الاستشعار في الميكعي ماوس الحادة الأنسجة إعداد شريحة

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

على تحليل من الخليوي بركينيي علم الصرف شجيرى في الثقافات شريحة عضوي النمط

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

تسجيل وتحليل إيقاعات الساعة البيولوجية في تشغيل عجلة النشاط في القوارض

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

الثقافات شريحة عضوي النمط لدراسة ديناميات دبقية قليلة التغصن وتكون الميالين

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

وتحليل وعائية عصبية إعادة عرض في Entorhino-الحصين الثقافات شريحة عضوي النمط

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Direct-current Stimulation and Multi-electrode Array Recording of Seizure-like Activity in Mice Brain Slice Preparation

تحفيز التيار المباشر ومتعدد القطب تسجيل صفيف من مثل الاستيلاء آخر في الفئران إعداد شريحة الدماغ

Cathodal transcranial direct-current stimulation (tDCS) induces suppressive effects on drug-resistant seizures. To perform effective actions, the ...