Name: slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus
Uploaded: 2011-02-15T18:00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato dal Medical Research Council svedese (K2009-75SX-21028-01-3, K2008-61x-20700-01-3); FONCICYT 000000000091984; le fondamenta della Jeansson, Söderström Königska sjukhemmet, Martha Lundqvist e Sigurd och Elsa Goljes Minne e Società Svedese di Medicina SLS-95151. Professor Gene D. Block, UCLA, si ringrazia per preziosi commenti sul manoscritto. Ringraziamo il dottor Michael Andäng e la dottoressa Helena Johard per il bloccante dei canali HCN, e il Prof. Abdel El-Manira per la fornitura di microscopio video. Considerazioni etiche: Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e dei regolamenti previsti dal Karolinska Institutet e &quot;Stoccolma Norra Djurförsöksetiska Nämnd&quot;. Tutti gli esperimenti su animali vengono eseguiti con l&#39;intento di ridurre al minimo ogni possibile stress o disagio per l&#39;animale.

<ol>
	<li>Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suprachiasmatic+nucleus:+cell+autonomy+and+network+properties.">Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties.</a> Annu Rev Physiol. 72, 551-577 (2010).</li><li>Green, D. 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Y., Klein, D., Moore, R., Reppert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+suprachiasmatic+nucleus+and+the+circadian+timing+system.">The suprachiasmatic nucleus and the circadian timing system.</a> Suprachiasmatic nucleus--The mind's clock. , 13-15 (1991).</li><li>Pol, A. N. V. a. n. d. e. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypothalamic+suprachiasmatic+nucleus+of+rat:+intrinsic+anatomy.">The hypothalamic suprachiasmatic nucleus of rat: intrinsic anatomy.</a> J Comp Neurol. 191, 661-702 (1980).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Yamazaki, S., Numano, R., Abe, M., Hida, A., Takahashi, R., Ueda, M., Block, G. D., Sakaki, Y., Menaker, M., Tei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resetting+central+and+peripheral+circadian+oscillators+in+transgenic+rats.">Resetting central and peripheral circadian oscillators in transgenic rats.</a> Science. 288, 682-685 (2000).</li><li>Geusz, M. E., Fletcher, C., Block, G. D., Straume, M., Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Kay, S. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+the+buffering+capacity+of+bicarbonate+in+the+rumen+and+in+vitro.">Calculation of the buffering capacity of bicarbonate in the rumen and in vitro.</a> J Anim Sci. 76, 1702-1709 (1998).</li><li>Wilsbacher, L. D., Yamazaki, S., Herzog, E. D., Song, E. J., Radcliffe, L. A., Abe, M., Block, G., Spitznagel, E., Menaker, M., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photic+and+circadian+expression+of+luciferase+in+mPeriod1-luc+transgenic+mice+in+vivo.">Photic and circadian expression of luciferase in mPeriod1-luc transgenic mice in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 489-494 (2002).</li><li>Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence/luminescence+circadian+imaging+of+complex+tissues+at+single-cell+resolution.">Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution.</a> J Biol Rhythms. 25, 228-232 (2010).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Vantaggi e svantaggi della tecnologia giornalista luciferasi In contrasto con ex metodi in vivo, come la RT-PCR, ibridazione in situ e Western blot che richiedono il campionamento dei tessuti in molti diversi momenti (per un periodo di bassa risoluzione di solito 2-4 ore a seconda della frequenza di campionamento) al fine di studiare diurno variazioni nelle espressioni dei geni e delle proteine, la tecnologia giornalista luciferasi permette ad alta risoluzione (1-10 min) studi di oscillazioni circadiane per molti giorni nella stessa preparazione. Gli studi in tal modo, il numero di animali utilizzati è ridotto al minimo e dettagliata degli effetti sulla fase e periodo del ritmo sono fattibili, che normalmente non è possibile utilizzando tecniche convenzionali di campionamento con risoluzione minimo storico. Tuttavia, anche se le misurazioni ampiezza relativa del ritmo sono possibili, va sottolineato che la tecnologia giornalista non è quantitativo e non può quindi essere utilizzato per misurare la quantità di geni trascritti o proteine ​​tradotte. Le registrazioni dei tessuti può essere avviato e analizzati immediatamente dopo la coltura, un grande vantaggio per studiare direttamente gli effetti molecolari dello stress in vivo, in vivo indotta dalla luce sfasamenti ecc cultura SCN organotipica permette di lungo periodo (settimane) la manipolazione farmacologica del cervello adulto tessuto contenente un intatto rete maturo sinaptica e la tecnologia giornalista luciferasi permette registrazioni stabile per molte settimane. Così, il tessuto non ha bisogno di essere neonatale o postnatale precoce al fine di ottenere colture sane e, in contrasto con l&#39;acuta fetta trattamenti farmacologici cronici possono essere eseguite. In contrasto con plasmide-reporter trasfezioni in colture cellulari, che non fanno portare alla incorporazione di DNA nel genoma, il transgenico-luciferasi modelli animali (così come Lenti-virus trasfezioni) sono favorevoli se alterazioni epigenetiche sono da studiare. Si deve in questo contesto inoltre ricordato che l&#39;imaging luminescenza è oggi possibile con telecamere CCD ad alta sensibilità 11, permettendo registrazioni anche nei neuroni SCN singola (~ 6-10 micron) e di altri tipi cellulari, utilizzati dai grandi laboratori studiando i ritmi circadiani. Infine, alcuni investigatori circadiano usa comunemente il monitoraggio di espressione molecolare con altri giornalisti, come la proteina fluorescente verde, al fine di studiare geni orologio / oscillazioni proteine ​​16-19. Aspetti di spessore della fetta Gli spessori qui raccomandato della fetta SCN (200-300 micron) potrebbe essere ridotto o aumentato, se desiderato. Tuttavia, anche se il tessuto si appiattisce sulla membrana dopo alcuni giorni di cultura, non è consigliabile superare i 500 micron di spessore della fetta inizialmente tagliati al fine di preservare la vitalità del tessuto 7. Una fetta più sottile di 100 micron è di ragioni meccaniche e pratiche difficili da maneggiare. Perché il tessuto SCN è eterogeneo lo spessore della fetta può influenzare la fase del segnale di uscita luciferasi, dal momento che diverse regioni del SCN (ad esempio il &quot;core&quot; rispetto al &quot;guscio&quot;, e delle regioni dorsali contro ventrale) oscillano con le diverse fasi 20 e differenziale re-sincronizzazione dopo sfasamenti 21. Lo spessore della fetta influisce anche sulla base del numero di fotoni da più tessuti emette un maggior numero di fotoni. L&#39;ampiezza delle oscillazioni molecolari possono in questo modo indirettamente essere influenzata dalle dimensioni del l&#39;espianto. Per queste ragioni, il controllo e colture trattate devono essere sempre delle stesse dimensioni, spessore e contenenti la stessa regione del SCN al fine di oscillare nella stessa fase e con la stessa ampiezza. I due nuclei unilaterale, invece, oscillano in fase tra loro e con ampiezze simili fino a quando il taglio vibratome è orizzontale e non inclinato (che a sua volta dipende dal taglio che la separazione tra il cervelletto e le due emisferi è perpendicolare per la superficie del tavolo). Un investigatore che esegue la coltura SCN possono verificare che le culture SCN non oscillano in fase tra loro. Praticare e standardizzazione della tecnica di taglio, cioè le fette sono sempre tagliati alla stessa rostro-caudale livello del SCN, migliorerà il risultato. Passaggi critici <ol><li> Apporto di ossigeno è fondamentale. Perché il cervello richiede un sacco di ossigeno 22, la procedura di taglio deve essere veloce (il più vicino è quello di 3,1-3,10 ~ 5-6 minuti il meglio è in modo da mantenere il tessuto sano). </li><li> Il SCN è sensibile alle variazioni di temperatura e lo scambio di media. Il SCN è sensibile alla temperatura e variazioni di temperatura possono grande sfasamento il pacemaker e causare artefatti sperimentali 23. Se media o soluzioni sono sostituiti o aggiunti durante un esperimento in corso, per esempio quando si applica un farmaco dopo un paio di giorni di cultura, i media o solution deve essere pre-riscaldato a 36-37 ° C (la stessa temperatura nella camera) prima di addizione. Negli esperimenti farmacologici che coinvolgono scambi di media, è importante lavorare sempre con la pre-condizione terreno di coltura cellulare. Inoltre / wash-out con fresco, mezzano incondizionato può potenzialmente sfasamento del ritmo molecolare SCN 24 nonché altre culture tipo di cellula 25. </li><li> Composizione media. E &#39;importante la cultura del tessuto di pH corretto e osmolalità. L&#39;aria-buffering terreno contiene una grande quantità di HEPES, che ha una capacità ottimale del buffer nel range di pH 6,8-8,2 ed è anche adatto per il buffering dei cambiamenti di pH che possono verificarsi a causa della respirazione cellulare. HEPES, invece, è più sensibile alle variazioni di temperatura rispetto al bicarbonato di sodio, che è incluso in piccole quantità nel terreno di coltura. Bicarbonato di sodio ha una maggiore capacità di tamponamento del pH più basso (5,1-7,1) Gamma 26, in tal modo appropriato in un CO 2 nell&#39;atmosfera. Tuttavia, una maggiore quantità di bicarbonato di sodio in aria-buffering medium (DMEM 2902) aumenta la osmolalità modo significativo e non può essere aggiunto senza contemporaneamente diluire il mezzo, che a sua volta nella composizione errata di aminoacidi, vitamine e ioni. Consigli per la preparazione del mezzo: <ol><li> Essere preciso e attento durante la miscelazione del mezzo. </li><li> Utilizzare soluzioni di riserva solo fresco o appena scongelato. </li><li> In caso di osmolalità molto elevato non vale la pena di diluizione. Più di 5-6% di media-diluita molto probabilmente non funziona. Usare D-glucosio per aumentare osmolalità se è troppo bassa. </li></ol></li><li> Fase turni a causa di tempi di preparazione Il tempo di preparazione fetta è critica. Effetto nullo o minimo sui fase si ottiene se la procedura viene eseguita fetta tra ZT 6-12 dicembre. Tutte le dissezioni fetta devono essere effettuate presso la stessa fase del ciclo diurno o circadiano al fine di minimizzare l&#39;errore dovuto alla variazione di fase tra i preparativi. </li></ol> Eventuali modifiche <ol><li> Per elettrofisiologia SCN acuta, il taglio deve essere eseguito con una suoneria (Artificial liquido cerebrospinale; ACSF) tampone, satura di ossigeno (95% O 2, 5% CO 2) prima dell&#39;inizio taglio. Inoltre, l&#39;ossigeno è necessario aggiungere continuamente al buffer durante l&#39;intera procedura taglio, in quanto l&#39;attività elettrica e sinaptica è direttamente dipendente dalla fornitura di ossigeno 22. </li><li> Fette orizzontale e sagittale può anche essere successo preparato e colto del SCN. Gli autori hanno esperienza con le registrazioni luciferasi a fette orizzontali, che secondo la nostra esperienza dare oscillazioni circadiano con minore ampiezza rispetto al taglio coronale. </li><li> Il SCN è di circa 1 mm di lunghezza rostro-caudale e la tecnica di taglio qui descritto è indirizzati verso l&#39;acquisizione di una sezione di SCN nella regione centrale. Tuttavia, più di una sezione SCN possono essere ottenute da topo e cervello dei topi, permettendo l&#39;indagine del gene circadiano / espressione della proteina a livelli più rostrale rispetto caudale del nucleo SCN. </li><li> Culture fetta da animali giovani, cuccioli o anche dopo la nascita degli embrioni, può anche essere preparati. Si prega di notare che il cervello e il cranio in cuccioli molto giovani sono molto morbidi e sensibili. Inoltre, il nervo ottico è sottile e non pienamente sviluppata. Fare attenzione quando sezionare il cervello dei cuccioli in modo che la regione SCN non sia danneggiato. Per esempio, i micro pinza ossivora strumenti non possono essere usati per aprire il cranio di cuccioli di topo, perché sono troppo grandi. Forbici sono sufficienti per tagliare i tessuti molli nei cuccioli giovani. </li><li> Il vetro di copertura tecnica basata cultura qui descritto può essere utilizzato anche per luminescenza immagine usando un CCD / EM-CCD, anche nei neuroni SCN singolo. </li><li> Altre regioni del sistema nervoso centrale e nei tessuti degli organi periferici da transgenici PER2:: LUC animali può essere facilmente ottenuto, colti e analizzati in termini di oscillazioni molecolari, come la PER2:: LUC espressione continua ad oscillare per molti giorni anche in diversi altri tessuti e tipi di cellule 10. La maggior parte di questi tessuti periferici, per il fegato esempio, non richiedono una membrana per la sopravvivenza, ma sono invece colti direttamente immerso nel mezzo 11. Si prega di notare che la fase di spostamento a causa di sezionamento, coltura e lo scambio di media non può seguire gli stessi principi di SCN. </li></ol> Significato In topi transgenici e ceppi di ratto (mPER2:: LUC; mPer1-luc 8, 10, 27) l&#39;attività enzimatica luciferasi riflette proteina o ritmi espressione genica e può essere valutato mediante la registrazione bioluminescenza. La luciferasi generati bioluminescenza dà un segnale debole, ma la luminescenza di fondo è vicino a zero, rendendo questo metodo vantaggioso. Inoltre, poiché la molecola luciferasi è instabile e rapidamente degradata non c&#39;è phototossicità, che possono comparire durante il lungo periodo di illuminazione eccitatori 28. Prese insieme, queste caratteristiche permettono di lunga durata esperimenti di rendere la tecnologia giornalista luciferasi altamente vantaggiosa in ricerca circadiano.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>B27 supplement 50x</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover glasses</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Menzel-Gl&auml;ser</td>
<td>40#1</td>
<td>&#8776; 40 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Culture membranes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>PICMORG50</td>
<td>0.4 &mu;m</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM low glucose w/o phenol red</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D2902</td>
<td>Powder for 1L</td>
</tr>
<tr>
<td>Filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>1003 055</td>
<td>&#8776; 55 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Filtration set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>431097</td>
<td>Pore size 0.22 &mu;m
Polyethersulfone</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Allgaier Instrumente</td>
<td>0203-7-PS</td>
<td>Dumant #7</td>
</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>15630-056</td>
<td>100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>HBSS 10x</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco </td>
<td>14065-049</td>
<td>500 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>NaOCH3 7.5%</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>25080-060</td>
<td>50 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Luciferin </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>E1602</td>
<td>Beetle luciferin, potassium salt</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro rongeur tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Allgaier Instrumente</td>
<td>332-097-140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PenStrep 10,000 U/ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430165</td>
<td>&#8776; 35 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>PMT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>H9319-11MOD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Disposable scalpels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Paragon</td>
<td>P503</td>
<td>Size 11</td>
</tr>
<tr>
<td>Vacuum filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher </td>
<td>09-761-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vacuum grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>50 g</td>
</tr>
<tr>
<td>Vibratome</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Campden Instruments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus

Una centrale circadiano (~ 24 ore) orologio coordinamento ritmi quotidiani in fisiologia e del comportamento risiede nel nucleo soprachiasmatico (SCN) che si trova nell&#39;ipotalamo anteriore. L&#39;orologio è sincronizzato direttamente dalla luce attraverso la retina e del nervo ottico. Oscillazioni circadiani sono generati attraverso l&#39;interazione feedback negativo di una serie di cosiddetti &quot;geni dell&#39;orologio&quot; ei loro prodotti proteici, compreso il periodo (al) geni. Il clock del core dipende anche dalla depolarizzazione della membrana, di calcio e campo 1. Il SCN mostra oscillazioni giornaliere di espressione del gene orologio, l&#39;attività metabolica e attività elettrica spontanea. Sorprendentemente, questa attività ciclica endogena persiste a fette tessuto adulto del SCN 2-4. In questo modo, l&#39;orologio biologico possono essere facilmente studiate in vitro, permettendo indagini molecolari, elettrofisiologici e metabolici della funzione di pacemaker. Il SCN è una piccola struttura ben definita bilaterale trova proprio sopra il chiasma ottico 5. Nel ratto contiene ~ 8,000 neuroni in ogni nucleo e ha dimensioni di circa 947 micron (lunghezza, asse rostrocaudal) x 424 micron (larghezza) x 390 micron (altezza) 6. A sezionare il SCN è necessario tagliare una fetta cervello a livello del cervello dove il SCN può essere identificato. Qui, descriviamo la procedura di dissezione e taglio del SCN, che è simile per il mouse e il cervello di ratto. Inoltre, ci mostra come la cultura del tessuto sezionato organotypically su una membrana 7, una tecnica sviluppata per la cultura SCN tessuto da Yamazaki et al. 8. Infine, abbiamo dimostrato come il tessuto transgenici possono essere usati per misurare l&#39;espressione dei geni orologio / proteine ​​utilizzando la tecnologia dinamica luciferasi giornalista, un metodo che in origine era usato per le misurazioni circadiano da Geusz et al. 9. Noi qui utilizzare tessuti SCN dal transgenico knock-in PERIOD2:: topi luciferasi prodotto da Yoo et al 10.. I topi contengono una proteina di fusione del PERIODO (PER) 2 e l&#39;enzima luciferasi lucciola. Quando PER2 si traduce nella presenza del supporto per la luciferasi, cioè luciferina, l&#39;espressione PER2 può essere monitorato come bioluminescenza quando luciferasi catalizza l&#39;ossidazione della luciferina. Il numero di fotoni emessi è correlato positivamente alla quantità di proteina prodotta PER2, ei ritmi bioluminescenza corrispondere al ritmo PER2 proteina in vivo 10. In questo modo la variazione ciclica nell&#39;espressione PER2 può essere continuamente monitorato in tempo reale durante molti giorni. Il protocollo che seguiamo per la coltura dei tessuti e la registrazione in tempo reale bioluminescenza è stato accuratamente descritto da Yamazaki e Takahashi 11.

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Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

La procedura di fette preparazione contenente l&#39;adulto del mouse nucleo ipotalamico soprachiasmatico (SCN), e un modo rapido per la cultura del tessuto SCN in condizioni cultura organotipica, sono segnalati. Inoltre, la misurazione della oscillatorio espressione della proteina del gene orologio utilizzando la tecnologia dinamica luciferasi giornalista è descritto.

Fetta Preparazione, coltura tissutale organotipica e Registrazione luciferasi di attività Clock gene nel nucleo soprachiasmatico

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

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