Name: slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus
Uploaded: 2011-02-15T18:00:00
Duration: 10 min 6 s
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FONCICYT 000000000091984; Jeansson、セーデルストレームKönigska sjukhemmet、マーサLundqvistさんとシグルドOCHエルザの基礎この作品は、スウェーデンの医学研究評議会（K2009 - 75SX - 21028〜01 - 3、K2008 - 61X - 20700〜01 - 3）によって賄われていたGoljesミンヌ、および医学SLS - 95151のスウェーデンの社会。教授ジーンD.ブロック、UCLAは、感謝して原稿上で貴重なコメントで知られています。我々はビデオ顕微鏡を提供するための博士マイケルAndäng博士とヘレナJohard HCNチャネルブロッカーのため、教授とアブデルエルManiraに感謝する。 倫理的配慮： 動物のすべての実験はカロリンスカ研究所と&quot;ストックホルムのノーラDjurförsöksetiska Nämnd&quot;で定められたガイドラインおよび規制に準拠して行った。全ての動物実験は、動物へのあらゆる可能なストレスや不快感を最小限に抑える目的で行われます。

<ol>
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J., Gillette, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythm+of+firing+rate+recorded+from+single+cells+in+the+rat+suprachiasmatic+brain+slice.">Circadian rhythm of firing rate recorded from single cells in the rat suprachiasmatic brain slice.</a> Brain Res. 245, 198-200 (1982).</li><li>Shibata, S., Oomura, Y., Kita, H., Hattori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythmic+changes+of+neuronal+activity+in+the+suprachiasmatic+nucleus+of+the+rat+hypothalamic+slice.">Circadian rhythmic changes of neuronal activity in the suprachiasmatic nucleus of the rat hypothalamic slice.</a> Brain Res. 247, 154-158 (1982).</li><li>Groos, G., Hendriks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+in+electrical+discharge+of+rat+suprachiasmatic+neurones+recorded+in+vitro.">Circadian rhythms in electrical discharge of rat suprachiasmatic neurones recorded in vitro.</a> Neurosci Lett. 34, 283-288 (1982).</li><li>Moore, R. 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Y., Honma, S., Honma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circadian+pacemaker+in+the+cultured+suprachiasmatic+nucleus+from+pup+mice+is+highly+sensitive+to+external+perturbation.">The circadian pacemaker in the cultured suprachiasmatic nucleus from pup mice is highly sensitive to external perturbation.</a> Eur J Neurosci. 27, 2686-2690 (2008).</li><li>Yoshikawa, T., Sellix, M., Pezuk, P., Menaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+the+ovarian+circadian+clock+is+regulated+by+gonadotropins.">Timing of the ovarian circadian clock is regulated by gonadotropins.</a> Endocrinology. 150, 4338-4347 (2009).</li><li>Kohn, R. A., Dunlap, T. 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T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence/luminescence+circadian+imaging+of+complex+tissues+at+single-cell+resolution.">Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution.</a> J Biol Rhythms. 25, 228-232 (2010).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

ルシフェラーゼレポーターの技術を持つメリットとデメリット昼間の勉強するために多くの異なる時点（サンプリング周波数に応じて、通常2-4時間の低時間分解能を与える）で組織採取を必要とするin situハイブリダイゼーション及びウエスタンブロットで 、このようなRT - PCRなどのex vivoでの方法とは対照的に、遺伝子と蛋白質の表現の変化、ルシフェラーゼレポーター技術は、高解像度（1-10分）と同じ準備で何日も概日振動の研究をすることができます。したがって、使用する動物の数は最小限に抑えられ、リズムの位相と周期への影響の詳細な研究は、通常、低時間分解能と、従来のサンプリング技術を利用可能ではない、実現可能である。しかし、リズムの相対的な振幅の測定が可能であるが、それはレポーター技術は定量的でないため、転写された遺伝子または翻訳されたタンパク質の量を測定するために使用することができないことが強調されるべきである。 組織の記録は、器官SCNの文化は成人の脳の長期的な（週）薬理学的操作を可能に開始し、直ちに培養、直接生体内光誘起位相シフトなどで 、 生体のストレスでの分子の影響を研究するための大きな利点の後に分析することができます無傷の成熟したシナプスのネットワークとルシフェラーゼレポーターの技術を含む組織は、何週間も安定した記録が可能になります。したがって、組織が健全な文化を得るために新生児または出生後早期にする必要はありません、と急性スライス慢性の薬理学的治療とは対照的に行うことができます。エピジェネティックな変化が検討される場合はないゲノムへのDNAの取り込みにつながるか細胞培養におけるプラスミド - レポータートランスフェクション、とは対照的に、トランスジェニックルシフェラーゼ - 動物モデル（だけでなく、レンティ-ウイルスのトランスフェクション）が良好である。それはこの文脈でも発光イメージングは、レコーディングにも概日リズムを研究の主要な研究室によって利用される単一のSCNのニューロン（〜60から10ミクロン）や他の細胞型、許されるように、高感度CCDカメラ11で、今日可能であることが述べられるべきである。最後に、いくつかの概日研究者は、一般的に時計遺伝子/蛋白質の振動16-19を勉強するために、そのような緑色蛍光タンパク質として、他のレポーターを用いた分子の発現のモニタリングを使用してください。 スライス厚の側面必要に応じて、ここで推奨SCNのスライス（200〜300ミクロン）の厚さが減少または増加させることができた。組織の文化の中で数日後に膜に平坦化するが、しかし、、それは組織7の実行可能性を維持するために最初にカットスライスの500μmの厚さを超えることは推奨されません。が100μmよりも薄いスライスは取り扱いが困難機械的および実際的な理由からです。 SCNの組織が不均質であるため、SCN（例えば、&quot;シェル&quot;と&quot;コア&quot;、と背比べ腹側の領域）内の異なる領域が異なる位相で振動するので、スライスの厚さは、ルシフェラーゼの出力信号の位相に影響を及ぼす可能性がありますフェーズの後に20と差動再同期は、21をシフト。より多くの組織は、光子の大きい数を発するので、スライスの厚さも光子数のベースラインに影響を与えます。分子振動の振幅は、このように間接的に植の大きさによって影響を受ける可能性があります。これらの理由から、制御と処理培養物は、常に同じ大きさ、厚さであることと同じ位相で、同じ振幅で発振するために、SCNの同じ領域を含む必要があります。 two一方的な核は、その一方で、ビブラトームカットが順番に小脳と二つの半球の間に切断分離が垂直であることに依存している水平方向と（角度がない限り、お互いにと同様の振幅と位相で振動するテーブルの表面に）。 SCNの培養を行う研究者は、SCNの文化は互いに位相で発振しないことが発生する可能性があります。練習とスライシング技術の標準化、スライスは常にSCNの同じrostro -尾レベルでカットされている、すなわち、結果が改善されます。 重要なステップ<ol><li>酸素供給は重要です。 脳は酸素22の多くを必要とするため、スライシング手続きは迅速である必要がある（3.1から3.10に近い、より良い、それが組織を健康に保つためにある〜5-6分です）。 </li><li> SCNは、温度変化や培地交換に敏感です。 SCNは、温度に敏感であり、大きな温度変化は、位相ペースメーカーをシフトし、実験的なアーティファクト23を引き起こす可能性があります。培地やソリューションは、培養中の数日後に薬を適用するなどの継続的な実験、、培地またはsolutio中に交換または追加される場合nは、さらに前に36〜37 ° C（チャンバー内と同じ温度）に事前に温める必要があります。培地交換を伴う薬理学的実験では、それは常に事前にエアコンの細胞培養培地と連携することが重要です。さらに/新鮮な、無条件の培地でアウト洗浄は、潜在的に分子のSCNのリズム24だけでなく、他の細胞型の培養25を位相シフトすることができます。 </li><li>培地組成物。 正しいpH及び浸透圧の文化組織をすることが重要です。空気緩衝培地はpHが6.8から8.2の範囲で最適なバッファ容量を持ち、細胞の呼吸の結果として発生する可能性のあるpHの変化をバッファリングするためにも適切であるHEPESが大量に含まれています。 HEPESは、一方、として培地中に少量に含まれている炭酸水素ナトリウム、と比較して温度変化に対して敏感です。重炭酸ナトリウムは、CO 2雰囲気下でこのように適切な低いpH（5.1〜7.1）範囲26内のより大きな緩衝能力を持っています。しかし、空気緩衝培地（DMEM 2902）に重炭酸ナトリウムの量を増加が大幅に浸透圧を増加させると同時に培地、アミノ酸、ビタミンおよびイオンの不正確な組成のターン結果に含めます。希釈することなく追加することができます。 培地を調製するためのアドバイス： <ol><li>媒体とを混合する際、正確なと注意してください。 </li><li>だけ新鮮か新鮮解凍したストック溶液を使用してください。 </li><li>非常に高い浸透圧の場合には、希釈する価値はありません。以上の5から6パーセントに希釈した培地は、ほとんどの場合動作しません。それが低すぎる場合浸透圧を高めるために、D -グルコースを使用してください。 </li></ol></li><li>フェーズは準備時間に起因するシフト スライス標本の時間は非常に重要です。スライスの手順はZT 6月12日12の間に実行された場合、位相でゼロまたは最小限の効果が得られる。すべてのスライスの解離は、準備の間の位相変動に起因する誤差を最小化するために、日周または概日周期の同位相で実行する必要があります。 </li></ol>実行可​​能な変更<ol><li>スライスが開始する前に酸素（95％O 2、5％CO 2）で飽和バッファー、急性SCNの電気生理学の場合、スライスはリンガー（ACSF人工脳脊髄液）で実行する必要があります。さらに、酸素は、電気とシナプス活動は、酸素の電源22に直接依存しているとして、全体のスライス手順の実行中にバッファに連続して追加する必要があります。 </li><li>水平方向と矢状スライスは正常に準備し、SCNを培養することができる。著者は、我々の経験によるとコロナのカットと比較して低い振幅で概日振動を与える水平スライスにおけるルシフェラーゼの録音と経験を、持っている。 </li><li> SCNはrostro - 尾側に長さ約1mmであるとスライシング技術は、ここで説明する中央部にSCNのセクションを取得を対象としています。ただし、複数のSCNのセクションは、SCNの核のより吻側対尾側レベルでの概日遺伝子/タンパク質発現の調査を可能にする、マウスおよびラットの脳から得ることができる。 </li><li>さらに、若い動物、出生後の仔や胚からスライスの培養物は、また、調製することができる。非常に若い子犬の脳と頭蓋骨は非常に柔らかく、敏感であることに注意してください。さらに、視神経は薄いと十分に発達していないです。 SCNの領域が損傷していないように仔の脳を解剖する際はご注意ください。彼らは大きすぎるので、例えば、マイクロ骨鉗子のツールは、仔マウスの頭蓋骨を開くために使用することができます。ファインはさみは若い仔で軟部組織を切断するのに十分です。 </li><li>ここで説明するカバーガラスベースの培養技術は、単一SCNのニューロンでは、CCD / EM - CCDカメラを用いた画像の発光にも使用できます。 </li><li>他の中枢神経系領域とトランスジェニックPER2から末梢器官組織：：LUCの動物が容易にPER2として、分子振動の面で、得られる培養し、分析することができます：：LUCの発現が他の組織の数にも多くの日のために発振し続けると細胞のタイプ10。これらの末梢組織のほとんどは、インスタンスの肝臓のために、生存のための膜を必要としないのではなく、直接媒体11を浴びて培養されています。により、切片にシフトその位相を注意してください、培養と培地交換はSCNと同じ原則に従っていない可能性があります。 </li></ol>意義トランスジェニックマウスとラット系統（：mPER2：LUC、mPer1 - lucを8、10、27）でルシフェラーゼ酵素活性は、タンパク質や遺伝子発現のリズムを反映し、生物発光の記録によって評価することができる。ルシフェラーゼによって生成される生物発光は、微弱な信号を与えるが、バックグラウンド発光は、この方法が有利なこと、ゼロに近いです。また、ルシフェラーゼ分子は不安定で速やかに分解されるためにはpHはありません長期的な興奮照明28の間に表示される可能性難聴、。一緒に、これらのプロパティは、概日研究において非常に有利なルシフェラーゼレポーターの技術を作る長期的な実験を可能にする。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>B27 supplement 50x</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover glasses</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Menzel-Gl&auml;ser</td>
<td>40#1</td>
<td>&#8776; 40 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Culture membranes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>PICMORG50</td>
<td>0.4 &mu;m</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM low glucose w/o phenol red</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D2902</td>
<td>Powder for 1L</td>
</tr>
<tr>
<td>Filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>1003 055</td>
<td>&#8776; 55 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Filtration set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>431097</td>
<td>Pore size 0.22 &mu;m
Polyethersulfone</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Allgaier Instrumente</td>
<td>0203-7-PS</td>
<td>Dumant #7</td>
</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>15630-056</td>
<td>100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>HBSS 10x</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco </td>
<td>14065-049</td>
<td>500 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>NaOCH3 7.5%</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>25080-060</td>
<td>50 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Luciferin </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>E1602</td>
<td>Beetle luciferin, potassium salt</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro rongeur tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Allgaier Instrumente</td>
<td>332-097-140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PenStrep 10,000 U/ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430165</td>
<td>&#8776; 35 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>PMT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>H9319-11MOD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Disposable scalpels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Paragon</td>
<td>P503</td>
<td>Size 11</td>
</tr>
<tr>
<td>Vacuum filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher </td>
<td>09-761-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vacuum grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>50 g</td>
</tr>
<tr>
<td>Vibratome</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Campden Instruments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
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slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus

生理学と行動で毎日のリズムを調整する中心的な概日リズム（〜24時間）クロックは、視床下部前部にある視交叉上核（SCN）に存在する。クロックは、直接網膜と視神経を介して光によって同期化されます。概日振動は、 周期 （ 単位 ）の遺伝子を含む、いわゆる&quot;時計遺伝子&quot;と、そのタンパク質産物の数、負のフィードバックループを相互作用によって生成されます。コアクロックはまた、膜の脱分極、カルシウムやキャンプ1に依存しています。 SCNは、時計遺伝子の発現、代謝活性と自発電気活動の毎日の振動を示しています。驚くべきことに、この内因性の周期的活動は、SCN 2-4の成体組織スライスに保持されます。この方法では、体内時計は簡単にペースメーカー機能の分子、電気生理学的及び代謝の研究を可能にする、in vitroで研究することができます。 SCNは、右の視交叉5の上方に位置する小規模な、よく定義された二国間の構造体です。ラットでは、それぞれの核に〜8.000ニューロンが含まれており、約947ミクロン（長さ、rostrocaudal軸）× 424μmの（幅）× 390μmの（高さ）6の寸法を有する。それは、SCNを識別することができる脳の特定のレベルでの脳のスライスをカットするために必要なSCNを分析する。ここで、我々は、マウスやラットの脳についても同様であるSCN、の解剖とスライスの手順を説明します。さらに、我々はどのように膜7、山崎らによってSCNの組織培養用に開発された技術上organotypically解剖組織培養に示す。8。最後に、我々は、動的なルシフェラーゼレポーターテクノロジー、もともとGeusz ら概測定に使用されたメソッドを使用して時計遺伝子/タンパク質の発現を測定するために使用する方法をトランスジェニック組織を示しています。9。 ：我々はトランスジェニックノックインPERIOD2からSCN組織をここでを使用してください：。ユジンらが生成されるルシフェラーゼマウス10。マウスは、PERIOD（PER）の融合タンパク質を含んで2とホタルの酵素ルシフェラーゼ。ルシフェラーゼは、ルシフェリンの酸化を触媒するときにルシフェラーゼの基質の存在下で翻訳されている場合PER2、すなわちルシフェリン、PER2の発現を生物発光として監視することができます。放出されるフォトンの数は、積極的に生産さPER2蛋白質の量に相関し、そして生物発光リズムは生体 10 で PER2蛋白質のリズムと一致している。この方法ではPER2の発現の周期的な変動が継続的に多くの日中にリアルタイムに監視することができます。我々は組織培養とリアルタイムの生物発光のレコーディングに従うプロトコルは、徹底的に山崎と高橋11で記載されている。

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Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

成体マウス視床下部視交叉上核（SCN）、そして文化への迅速な方法器官培養条件下でのSCNの組織を含む準備スライス、の手順が報告されています。さらに、動的なルシフェラーゼレポーターの技術を使用して振動時計遺伝子のタンパク質発現の測定が記述されています。

スライスの準備、器官組織培養と視交叉上核における時計遺伝子の活動のルシフェラーゼ記録

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

神経損傷を調べるための器官型海馬スライス培養モデル

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Organotypic Hippocampal Slice Cultures

器官型海馬切片培養

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Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

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Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

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Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

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When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

同時電気生理学的記録および視交叉上核ニューロンのカルシウムイメージング

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

オリゴデンドロサイトダイナミクスと髄鞘形成を研究するための器官型スライス培養

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Entorhino海馬器官型スライス培養における神経血管リモデリングの解析

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Direct-current Stimulation and Multi-electrode Array Recording of Seizure-like Activity in Mice Brain Slice Preparation

マウス脳スライスの準備中に発作のような活動の直流刺激とマルチ電極アレイ録音

Cathodal transcranial direct-current stimulation (tDCS) induces suppressive effects on drug-resistant seizures. To perform effective actions, the ...