Name: slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus
Uploaded: 2011-02-15T18:00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus at JoVE.com

FONCICYT 000000000091984,, Jeansson의 기초, Söderström Königska sjukhemmet, 마사 Lundqvist 및 시거드 루시 엘사이 작품은 스웨덴 의학 연구 협의회 (K2009 - 75SX - 21028-01 - 3, K2008 - 61X - 20700-01 - 3)에 의해 추진하는 사업 Goljes 민, 그리고 의약 SLS - 95151의 스웨덴어 학회. 교수 진 D. 블록, UCLA는 기꺼이 원고에 대한 귀중한 의견을 인정받고 있습니다. 우리는 비디오 현미경 제공을위한 HCN 채널 차단에 대한 박사 마이클 Andäng 및 박사 헬레나 Johard 감사하고, 교수 압델 엘 - Manira. 윤리적인 고려 사항 : 동물의 모든 실험은 Karolinska Institutet와 &quot;스톡홀름의 Norra Djurförsöksetiska Nämnd&quot;에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다. 모든 동물 실험은 모든 가능한 응력이나 동물에 불편을 최소화하기 위해 의도로 수행됩니다.

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	<li>Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suprachiasmatic+nucleus:+cell+autonomy+and+network+properties.">Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties.</a> Annu Rev Physiol. 72, 551-577 (2010).</li><li>Green, D. J., Gillette, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythm+of+firing+rate+recorded+from+single+cells+in+the+rat+suprachiasmatic+brain+slice.">Circadian rhythm of firing rate recorded from single cells in the rat suprachiasmatic brain slice.</a> Brain Res. 245, 198-200 (1982).</li><li>Shibata, S., Oomura, Y., Kita, H., Hattori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythmic+changes+of+neuronal+activity+in+the+suprachiasmatic+nucleus+of+the+rat+hypothalamic+slice.">Circadian rhythmic changes of neuronal activity in the suprachiasmatic nucleus of the rat hypothalamic slice.</a> Brain Res. 247, 154-158 (1982).</li><li>Groos, G., Hendriks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+in+electrical+discharge+of+rat+suprachiasmatic+neurones+recorded+in+vitro.">Circadian rhythms in electrical discharge of rat suprachiasmatic neurones recorded in vitro.</a> Neurosci Lett. 34, 283-288 (1982).</li><li>Moore, R. Y., Klein, D., Moore, R., Reppert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+suprachiasmatic+nucleus+and+the+circadian+timing+system.">The suprachiasmatic nucleus and the circadian timing system.</a> Suprachiasmatic nucleus--The mind's clock. , 13-15 (1991).</li><li>Pol, A. N. V. a. n. d. e. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypothalamic+suprachiasmatic+nucleus+of+rat:+intrinsic+anatomy.">The hypothalamic suprachiasmatic nucleus of rat: intrinsic anatomy.</a> J Comp Neurol. 191, 661-702 (1980).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Yamazaki, S., Numano, R., Abe, M., Hida, A., Takahashi, R., Ueda, M., Block, G. D., Sakaki, Y., Menaker, M., Tei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resetting+central+and+peripheral+circadian+oscillators+in+transgenic+rats.">Resetting central and peripheral circadian oscillators in transgenic rats.</a> Science. 288, 682-685 (2000).</li><li>Geusz, M. E., Fletcher, C., Block, G. D., Straume, M., Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Kay, S. A., RN, D. a. y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+monitoring+of+circadian+rhythms+in+c-fos+gene+expression+from+suprachiasmatic+nucleus+cultures.">Long-term monitoring of circadian rhythms in c-fos gene expression from suprachiasmatic nucleus cultures.</a> Curr Biol. 7, 758-766 (1997).</li><li>Ko, C. H., Buhr, E. D., Siepka, S. M., Hong, H. K., Oh, W. J., Yoo, O. J., Menaker, M., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PERIOD2::LUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues.">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 5339-5346 (2004).</li><li>Yamazaki, S., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+luminescence+reporting+of+circadian+gene+expression+in+mammals.">Real-time luminescence reporting of circadian gene expression in mammals.</a> Methods Enzymol. 393, 288-301 (2005).</li><li>Yoshikawa, T., Yamazaki, S., Menaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+preparation+time+on+phase+of+cultured+tissues+reveal+complexity+of+circadian+organization.">Effects of preparation time on phase of cultured tissues reveal complexity of circadian organization.</a> J Biol Rhythms. 20, 500-512 (2005).</li><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (1997).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The rat brain in stereotaxic coordinates. , (1998).</li><li>O'Neill, J. S., Maywood, E. S., Chesham, J. E., Takahashi, J. S., Hastings, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP-dependent+signaling+as+a+core+component+of+the+mammalian+circadian+pacemaker.">cAMP-dependent signaling as a core component of the mammalian circadian pacemaker.</a> Science. 320, 949-953 (2008).</li><li>Hughes, A. T., Guilding, C., Lennox, L., Samuels, R. E., McMahon, D. G., Piggins, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+altered+period1+expression+in+the+suprachiasmatic+nuclei+of+Vipr2-/-+mice.">Live imaging of altered period1 expression in the suprachiasmatic nuclei of Vipr2-/- mice.</a> J Neurochem. 106, 1646-1657 (2008).</li><li>Zhang, D. Q., Zhou, T., Ruan, G. X., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythm+of+Period1+clock+gene+expression+in+NOS+amacrine+cells+of+the+mouse+retina.">Circadian rhythm of Period1 clock gene expression in NOS amacrine cells of the mouse retina.</a> Brain Res. 1050, 101-109 (2005).</li><li>Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biological+clock+nucleus:+a+multiphasic+oscillator+network+regulated+by+light.">The biological clock nucleus: a multiphasic oscillator network regulated by light.</a> J Neurosci. 23, 8070-8076 (2003).</li><li>LeSauter, J., Yan, L., Vishnubhotla, B., Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G., Silver, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+short+half-life+GFP+mouse+model+for+analysis+of+suprachiasmatic+nucleus+organization.">A short half-life GFP mouse model for analysis of suprachiasmatic nucleus organization.</a> Brain Res. 964, 279-287 (2003).</li><li>Nakamura, W., Yamazaki, S., Takasu, N. N., Mishima, K., Block, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+response+of+Period+1+expression+within+the+suprachiasmatic+nucleus.">Differential response of Period 1 expression within the suprachiasmatic nucleus.</a> J Neurosci. 25, 5481-5487 (2005).</li><li>Davidson, A. J., Yamazaki, S., Arble, D. M., Menaker, M., Block, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resetting+of+central+and+peripheral+circadian+oscillators+in+aged+rats.">Resetting of central and peripheral circadian oscillators in aged rats.</a> Neurobiol Aging. 29, 471-477 (2008).</li><li>Croning, M. D., Haddad, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+brain+slice+chamber+designs+for+investigations+of+oxygen+deprivation+in+vitro.">Comparison of brain slice chamber designs for investigations of oxygen deprivation in vitro.</a> J Neurosci Methods. 81, 103-111 (1998).</li><li>Burgoon, P. W., Boulant, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-sensitive+properties+of+rat+suprachiasmatic+nucleus+neurons.">Temperature-sensitive properties of rat suprachiasmatic nucleus neurons.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 281, 706-715 (2001).</li><li>Nishide, S. Y., Honma, S., Honma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circadian+pacemaker+in+the+cultured+suprachiasmatic+nucleus+from+pup+mice+is+highly+sensitive+to+external+perturbation.">The circadian pacemaker in the cultured suprachiasmatic nucleus from pup mice is highly sensitive to external perturbation.</a> Eur J Neurosci. 27, 2686-2690 (2008).</li><li>Yoshikawa, T., Sellix, M., Pezuk, P., Menaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+the+ovarian+circadian+clock+is+regulated+by+gonadotropins.">Timing of the ovarian circadian clock is regulated by gonadotropins.</a> Endocrinology. 150, 4338-4347 (2009).</li><li>Kohn, R. A., Dunlap, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+the+buffering+capacity+of+bicarbonate+in+the+rumen+and+in+vitro.">Calculation of the buffering capacity of bicarbonate in the rumen and in vitro.</a> J Anim Sci. 76, 1702-1709 (1998).</li><li>Wilsbacher, L. D., Yamazaki, S., Herzog, E. D., Song, E. J., Radcliffe, L. A., Abe, M., Block, G., Spitznagel, E., Menaker, M., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photic+and+circadian+expression+of+luciferase+in+mPeriod1-luc+transgenic+mice+in+vivo.">Photic and circadian expression of luciferase in mPeriod1-luc transgenic mice in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 489-494 (2002).</li><li>Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence/luminescence+circadian+imaging+of+complex+tissues+at+single-cell+resolution.">Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution.</a> J Biol Rhythms. 25, 228-232 (2010).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

루시페라제 리포터 기술과 장점과 단점 낮의를 공부하기 위해서는 여러 시간 포인트 (샘플링 주파수에 따라 일반적으로 2-4 시간의 낮은 시간 해상도를 제공)에서 조직 샘플을 필요로 원위치 하이브리드화과 서양 얼룩 이러한 RT - PCR로 전직 생체내 방법, 달리 유전자와 단백질 표현의 변화, 루시페라제 리포터 기술은 높은 해상도 (10-10 분) 같은 준비에 많은 일 동안 circadian oscillations의 연구를 수 있습니다. 리듬의 위상 및 기간에 대한 효과 그러므로, 사용하는 동물의 수를 최소화하고 상세한 연구는 일반적으로 낮은 시간 해상도로 기존의 샘플링 기법을 사용 불가능한지, 가능합니다. 리듬의 상대 진폭 측정이 가능 있지만 그러나, 그것은 기자의 기술은 양적하지 않으며 따라서 베꼈는데 유전자 또는 단백질 번역의 양을 측정하는 데 사용할 수 없다는 것을 강조해야합니다. 조직 녹음 organotypic SCN 문화는 성인 뇌의 장기 (주) 약리 조작을 허용하기 시작하고 즉시 culturing, 직접 생체내 빛을 유도 위상 교대 등, 생체내 스트레스의 분자 효과를 공부에 대한 큰 장점 후 분석할 수 손상 성숙한 신경 네트워크와 루시페라제 리포터 기술을 포함하는 조직은 여러 주 동안 안정적인 레코딩이 가능합니다. 따라서 조직은 건강한 문화를 얻기 위해서는 신생아 또는 출생 후의 초기 필요하지 않으며, 급성 만성 슬라이스 약리 치료와는 대조적으로 수행할 수 있습니다. epigenetic 변경은 연구해야하는 경우없이 염색체에 DNA의 결합으로 이어질 할 셀 문화에 플라스미드 - 기자 transfections, 대조적으로, 유전자 변형 루시페라제 - 동물 모델 (뿐만 아니라 lenti 바이러스 transfections)이 유리합니다. 그것은이 상황에서도 발광 이미징은 녹음도 circadian 리듬을 공부 전공 실험실로 활용 단일 SCN의 뉴런 (~ 60-10 μm의)와 다른 세포 유형에 있으므로, 매우 민감한 CCD 카메라 11 요즘 가능하다는 것을 언급해야합니다. 마지막으로, 여러 circadian 조사는 일반적으로 시계 유전자 / 단백질 oscillations 16-19를 공부하기 위해서는 이러한 그린 형광 단백질과 같은 다른 기자를 사용하여 분자 표현의 모니터링을 사용합니다. 슬라이스 두께의 측면 여기에서 권장하는 SCN 슬라이스 (200-300 μm의)의 두께가 감소하거나 원할 경우 증가 수 있습니다. 조직 문화의 몇 일 후에 막에 나가 flattens하지만 그러나, 그것은 조직 7 생존을 보존하기 위해 처음 컷 단면 500 μm의 두께를 초과하지 않는 것이 좋습니다. 100 μm의보다 얇은 슬라이스가 처리하기 어려운 기계 및 실질적인 이유입니다. SCN (예를 들어 &#39;껍질&#39;, 그리고 지느러미 대 복부 지역 대의 &quot;핵심&quot;) 이내에 다른 지역은 다른 단계와 함께 진동 SCN 조직 이질 때문에 슬라이스의 두께가 루시페라제 출력 신호의 위상에 영향을 미칠 수, 이후 20 differentially이 단계 이후에 다시 동기화 21 교대. 더 많은 조직이 광자의 큰 숫자를 방출 이후 슬라이스의 두께는 광자 개수의 기준에 영향을 미칩니다. 분자 oscillations의 진폭이 방식으로 간접적으로 explant의 크기에 의해 영향을받을 수 있습니다. 이러한 이유로, 제어 및 치료 문화는 항상 같은 크기, 두께가 같은 위상과 같은 진폭과 진동하기 위하여 SCN의 동일한 영역을 포함해야합니다. 두 일방적 핵은 반면에, 서로와 한 유사한 amplitudes와 단계에 진동 vibratome 컷 (차례로 소뇌와 두 반구 사이의 절단 분리는 직각입니다에 의존하는 직각 수평이 아니므로 테이블 표면). SCN의 culturing을 수행하는 조사는 SCN의 문화가 서로 단계에서 진동하지 않는 경험을 할 수도 있습니다. 연습과 깔끔히 기술의 표준화, 조각은 항상 SCN의 동일한 rostro - 꼬리 수준 버렸어요 즉, 결과를 향상됩니다. 중요 단계 <ol><li> 산소 공급이 중요합니다. 두뇌는 산소 22이 많이 필요하기 때문에, 깔끔히 절차 빨리해야합니다 (3.1-3.10 가까이수록 그것은 조직을 건강하게 유지하기 위해서입니다 ~ 5~6분하는 것입니다.) </li><li> SCN은 온도 변화와 매체 교환을 구분합니다. SCN은 온도 민감하고 큰 온도 변화가 단계 맥박 조정기를 이동하고 실험 유물 23가 발생할 수 있습니다. 중간이나 솔루션은 문화에 며칠 후에 약물을 적용하는 예를 들어, 지속적인 실험, 매체 또는 솔루션을 도중에 교환 또는 추가하는 경우n은 사전 예열 36-37로 ° C (챔버와 동일한 온도)뿐만 아니라 전에해야합니다. 중간 교류를 포함 약리 실험에서, 항상 사전에 시설 세포 배양 매체와 함께 작업하는 것이 중요합니다. 또한 / 신선한와 함께 씻어, 무조건 매체는 잠재적으로 분자 SCN 리듬 24뿐만 아니라 다른 세포 유형 문화 25 단계 이동하실 수 있습니다. </li><li> 중간 구성. 정확한 산도와 osmolality 문화 조직을하는 것이 중요합니다. 공기 버퍼링 매체 산도 6.8-8.2의 범위에서 최적의 버퍼 용량을 가지고 있으며, 세포 호흡의 결과로 발생할 수있는 산도의 변화를 버퍼링에 적합합니다 HEPES 많은 양의가 포함되어 있습니다. HEPES는 반면에, 같은 문화 매체 소량에 포함되어있는 나트륨 중탄산염,에 비해 온도 변화에 더 민감합니다. 나트륨 중탄산염는 CO 2 분위기 때문에 적절한 낮은 PH (5.1-7.1) 범위 26에서 큰 버퍼링 용량이 있습니다. 그러나, 공기 버퍼링 매체 (DMEM 2902)에서 나트륨 중탄산염의 금액을 증가 상당히 osmolality를 증가 동시에 매체, 아미노산, 비타민 및 이온의 잘못된 구성에 차례 결과 인치를 diluting없이 추가할 수 없습니다 매체를 준비 조언 : <ol><li> 매체를 혼합하면 정확하고주의하십시오. </li><li> 오직 신선한 또는 갓 해동 주식 솔루션을 사용합니다. </li><li> 매우 높은 osmolality의 경우 그것은 diluting 가치가되지 않습니다. 이상 5~6% - 희석 매체는 대부분 작동하지 않습니다. 너무 낮으면 osmolality를 증가 D - 포도당을 사용합니다. </li></ol></li><li> 단계는 준비 시간으로 인해 교대 슬라이스 준비의 시간은 중요합니다. 슬라이스 절차가 ZT 12월 6일부터 12일까지 사이에 수행되는 경우에는 단계에 제로 또는 최소한의 효과를 얻을 수 있습니다. 모든 슬라이스 해부은 준비 사이의 유사 콘텐츠를 위상으로 인한 오류를 최소화하기 위해 낮의 또는 circadian 사이클의 동일한 단계에서 수행해야합니다. </li></ol> 가능한 수정 <ol><li> 깔끔히 시작하기 전에 산소 (95% O 2, 5 % CO 2)의 포화 버퍼; 급성 SCN의 전기 생리학은 깔끔히는 링어 (ACSF 인공 세리 브로 척수)으로 수행되어야한다. 또한, 산소는 전기 시냅스 활동이 산소 공급 22에 직접 의존으로 전체 깔끔히 절차를 수행하는 동안 버퍼에 지속적으로 추가되어야합니다. </li><li> 수평 및 화살 조각도 성공적으로 준비하고 SCN의 교양 수 있습니다. 저자는 코로나 컷과 비교 경험에 따라 낮은 진폭과 circadian oscillations를 제공 수평 조각에 루시페라제 기록과 경험을했습니다. </li><li> SCN은 약 1mm 길이 rostro - caudally이며 깔끔히 여기에서 설명한 기법은 중앙 지역의 SCN 부분을 취득으로 타겟팅됩니다. 그러나, 하나 이상의 SCN 섹션은 SCN의 핵보다 주동이의 비교 꼬리 수준 circadian 유전자 / 단백질 표현의 조사를 허용, 마우스 및 쥐 두뇌에서 구할 수 있습니다. </li><li> 심지어 어린 동물, 출생 후의 새끼 또는 배아에서 슬라이스 문화가도 준비하실 수 있습니다. 아주 어린 새끼의 두뇌와 두개골이 아주 부드럽고 구분 유의하시기 바랍니다. 또한, 시신경이 얇고 완벽하게 개발되지 않습니다. SCN 영역이 손상되지 않도록 새끼의 머리를 해부 때주의를 가져가라. 그들이 너무 큰 있기 때문에 예를 들어, 마이크로 rongeur 도구는 마우스 새끼의 두개골을 열어 사용할 수 없습니다. 좋은 가위는 어린 새끼에있는 부드러운 조직을 절단 정도입니다. </li><li> 여기에 설명된 커버 유리 기반 문화 기술은 또한 하나의 SCN의 뉴런에서 CCD / EM - CCD 카메라를 사용하여 이미지 발광에도 사용할 수 있습니다. </li><li> 기타 중추 신경계의 지역 및 유전자 변형 PER2에서 말초 장기의 조직 : 루크 동물 쉽게 PER2로, 분자 oscillations 측면에서 얻은 교양 및 분석할 수 : 루크 표현은 다른 조직의 숫자도 많은 일 동안 진동을 계속 및 세포 유형 10. 이러한 주변 조직의 대부분은 인스턴스 간, 생존을위한 멤브레인 필요하지 않지만 대신에 직접적으로 매체 11 목욕 양식입니다. 인해 sectioning로 변화되는 단계는, culturing와 매체 교환이 SCN과 동일한 원칙을 따르지 않을 수 있습니다 주시기 바랍니다. </li></ol> 의미 유전자 변형 마우스 및 쥐 종자 (mPER2 : 륙, mPer1 - 륙 8, 10, 27)에서 루시페라제 효소 활동은 단백질이나 유전자 발현의 리듬을 반영하고 bioluminescence 기록에 의해 평가하실 수 있습니다. 루시페라제 생성된 bioluminescence는 약한 신호를 제공하지만 배경 발광이 방법이 유리하고, 제로에 가까운 것입니다. 또한, 루시페라제 분자가 불안정하고 급속하게 저하되기 때문에 PH가 없습니다장기적인 흥분성의 조명 28 동안 나타날 수 있습니다 ototoxicity. 함께 촬영이 속성은 circadian 연구 루시페라제 리포터 기술이 매우 유리하게 오랫동안 실험 수 있습니다.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>B27 supplement 50x</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover glasses</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Menzel-Gl&auml;ser</td>
<td>40#1</td>
<td>&#8776; 40 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Culture membranes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>PICMORG50</td>
<td>0.4 &mu;m</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM low glucose w/o phenol red</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D2902</td>
<td>Powder for 1L</td>
</tr>
<tr>
<td>Filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>1003 055</td>
<td>&#8776; 55 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Filtration set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>431097</td>
<td>Pore size 0.22 &mu;m
Polyethersulfone</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Allgaier Instrumente</td>
<td>0203-7-PS</td>
<td>Dumant #7</td>
</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>15630-056</td>
<td>100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>HBSS 10x</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco </td>
<td>14065-049</td>
<td>500 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>NaOCH3 7.5%</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>25080-060</td>
<td>50 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Luciferin </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>E1602</td>
<td>Beetle luciferin, potassium salt</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro rongeur tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Allgaier Instrumente</td>
<td>332-097-140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PenStrep 10,000 U/ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430165</td>
<td>&#8776; 35 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>PMT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>H9319-11MOD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Disposable scalpels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Paragon</td>
<td>P503</td>
<td>Size 11</td>
</tr>
<tr>
<td>Vacuum filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher </td>
<td>09-761-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vacuum grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>50 g</td>
</tr>
<tr>
<td>Vibratome</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Campden Instruments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus

생리와 행동의 일상 리듬을 조정 중앙 circadian (~ 24 시간) 시계 앞쪽에 시상 하부에있는 suprachiasmatic 핵 (SCN)에 있습니다. 시계는 직접 망막과 시신경을 통해 빛이 의해 동기화됩니다. Circadian oscillations는 시대 (당) 유전자를 포함하는 소위 &quot;시계 유전자&quot;와 그들의 단백질 제품의 여러 부정적인 피드백 루프를 상호 작용에 의해 생성됩니다. 코어 클럭은 멤브레인 탈분극, 칼슘 및 캠프 1에 따라 달라집니다. SCN은 시계 유전자 발현, 신진 대사 활동과 자발적인 전기적 활동에 매일 oscillations을 보여줍니다. 현저하게,이 내생 순환 활동 SCN 2-4 성인 조직 슬라이스에 지속. 이러한 방법으로 생물 학적 시계는 쉽게 맥박 조정기 함수의 분자, electrophysiological 및 신진 대사 조사를 허용, 체외에서 공부하실 수 있습니다. SCN 바로 광학 chiasm 5 위에있는 작은, 잘 정의된 양자 구조입니다. 쥐에서는 각 핵에서 ~ 8.000 뉴런을 포함하여 약 947 μm의 (길이, rostrocaudal 축) × 424 μm의 (폭) × 390 μm의 (높이) 6 규격이 있습니다. 그것은 SCN이 확인할 수 있습니다 두뇌의 특정 수준에서 뇌 슬라이스를 잘라하는 데 필요한 SCN을 해부하다합니다. 여기서는 마우스 및 쥐 머리가 비슷합니다 SCN의 해부와 깔끔히 절차를 설명합니다. 또한, 우리는 어떻게 막 7, 야마자키 외 의해 SCN 조직 문화의 개발 기술에 organotypically 해부하는 조직 문화를 보여줍니다. 8. 마지막으로, 우리는 유전자 변형 조직은 시계 유전자 / 동적 루시페라제 리포터 기술, 원래 Geusz 외 의해 circadian 측정에 사용된 방법입니다. 9를 사용 단백질의 표현을 측정하는 데 사용할 수 방법을 보여줍니다. 우리는 여기서 유전자 변형에서 SCN의 조직을 사용하는 PERIOD2 인 노크 : 유 외 제작한 루시페라제 쥐 10.. 마우스는 시대의 융합 단백질 (당) 2 반딧불의 효소 루시페라제가 포함되어 있습니다. 루시페라제은 luciferin의 산화를 catalyzes 때 PER2가 루시페라제 즉, luciferin을위한 기판의 존재로 번역하면 PER2 표현식은 bioluminescence으로 모니터링할 수 있습니다. 방출 광자의 개수는 긍정적으로 생산 PER2 단백질의 금액에 상호 및 bioluminescence 리듬은 생체내 10 PER2 단백질 리듬을 일치합니다. 이런 방식으로 PER2 표현의 주기적 변화는 지속적으로 며칠 동안 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 우리가 조직 culturing 실시간 bioluminescence 기록에 대한 수행 프로토콜은 철저하게 야마자키와 다카하시 11 설명했습니다.

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Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

성인 마우스 hypothalamic suprachiasmatic 핵 (SCN), 그리고 문화에 빠른 방법 organotypic 문화 상태에있는 SCN의 조직을 포함 준비 슬라이스의 절차가보고됩니다. 또한, 동적 루시페라제 리포터 기술을 사용하여 oscillatory 시계 유전자 단백질 표현의 측정이 설명되어 있습니다.

슬라이스 준비, Organotypic 조직 Culturing과 Suprachiasmatic 핵의 시계 유전자 활동의 루시페라제 녹음

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

의 연결을 부상을 검사에 대한 Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화 모델

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

연구

신경과학

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

네크로 텍스의 Organotypic 슬라이스 준비에서 전체 셀 녹음

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

이미징 페로몬은 마우스 Vomeronasal 급성 조직 슬라이스 준비에 감지

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Organotypic 슬라이스 문화의 Purkinje 세포 수지상의 형태학의 분석

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

쥐에 활동 륜 실행에 녹음 및 Circadian 리듬 분석

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Organotypic 슬라이스는 문화 희소 돌기 아교 세포 역학 및 수초화을 공부하기

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

에서 신경 혈관 리모델링의 분석 Entorhino - 해마 Organotypic 슬라이스 문화

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Direct-current Stimulation and Multi-electrode Array Recording of Seizure-like Activity in Mice Brain Slice Preparation

마우스 뇌 조각 준비에서 발작 같은 활동의 직류 자극 및 다중 전극 배열 기록

Cathodal transcranial direct-current stimulation (tDCS) induces suppressive effects on drug-resistant seizures. To perform effective actions, the ...