Name: protocol for recombinant rbd-based sars vaccines: protein preparation, animal vaccination and neutralization detection
Uploaded: 2011-05-02T15:00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection at JoVE.com

Este estudo foi financiado pelo National Institutes of Health (NIH) dos Estados Unidos (RO1 AI68002).

1. Recombinante SARS-CoV Preparação Protein RBD <ol><li> Prepare cálcio reagentes de transfecção de fosfato <ol><li> 2X tampão HBS preparação: Misture 16 g de NaCl, 0,4 g de Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, e 13,0 g de HEPES. Ajustar o pH a 7,00 e educação de volume total para 1000 mL em água destilada. Depois de filtrar a solução para alíquota de esterilização, e armazená-lo a -20 ° C. Dica: Qualquer variação do valor de pH afetaria os resultados transfecção. Assim, é aconselhável testar vários valores de pH em torno de 7,00 (por exemplo, 6,99, 7,00, ou 7,01) e encontrar o melhor para a transfecção usando o método introduzido abaixo. </li><li> 2,5 M CaCl 2 preparação: Adicionar 73,5 g de CaCl 2 * 2H 2 O em água destilada em um volume final de 200 mL. Filtrar a solução e armazenar a -20 ° C. </li></ol></li><li> Transfecção do plasmídeo recombinante e proteína de purificação <ol><li> Dividir células 293T em 50-70% 24 h antes de confluência de transfecção. Cultivar células em T-175 cm 2 frascos de cultura de tecidos em 40 mL DMEM contendo 10% inativado pelo calor (HI) FBS e 1% Penicilina / Estreptomicina (P / S) a 37 ° C em 5% CO 2. </li><li> Todos os reagentes de transfecção deve ser trazido à temperatura ambiente antes de transfecção. Estes reagentes incluem 2X HBS, 2.5M CaCl 2, Dih 2 O, e rRBD 6 plasmídeo. Dica: O plasmídeo recombinante final de construção usado para a expressão da proteína deve conter um peptídeo sinal para garantir a secreção de proteínas recombinantes expressas para o sobrenadante da cultura. A tag Sua 6x pode ser adicionado ao C-terminal da proteína expressa para a purificação fácil. </li><li> Prepare uma mL 50 (A) e um 15 mL (B) BD tubo Falcon, e adicionar os reagentes aos tubos, como indicado na Tabela 1. Adicionar 2X tampão HBS para A. tubo no tubo B, adicionar 2,5 milhões de CaCl 2 e rRBD plasmídeo, e levar o volume para a exigência da Dih 2 O. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> A. Um T-175 cm 2 frasco de cultura de tecidos (4000 mL / frasco): preparar para a expressão rRBD </td></tr><tr><td colspan="2"> Um tubo </td><td colspan="2"> Tubo B </td></tr><tr><td> 2X HBS </td><td> 2000 mL </td><td> 2.5M CaCl 2 </td><td> 200 mL </td></tr><tr><td></td><td></td><td> DNA plasmídeo rRBD </td><td> 40 mcg </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Dih 2 O para </td><td> 2000 mL </td></tr><tr><td colspan="4"> B. Um de 100 mm placa de Petri (1000 mL / prato): preparar-se para SARS produção pseudovirus </td></tr><tr><td colspan="2"> Um tubo </td><td colspan="2"> Tubo B </td></tr><tr><td> 2X HBS </td><td> 500 mL </td><td> 2.5M CaCl 2 </td><td> 50 mL </td></tr><tr><td></td><td></td><td> DNA plasmídeo SARS-CoV S </td><td> 5 mg </td></tr><tr><td></td><td></td><td> HIV-1 plasmídeo (pNL4-3.luc.RE) </td><td> 5 mg </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Dih 2 O para </td><td> 500 mL </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Preparação da mistura Transfection e volumes Os volumes listados na Tabela 1 são para uma unidade de transfecção. Se frascos mais ou pratos são utilizados para a transfecção, ajustar volumes em conformidade. </li><li> Adicionar a solução de DNA de cálcio no tubo B no tubo A de uma forma gota a gota, mantendo constante e suave a mistura em um vórtice. Deixe a mistura descansar em temperatura ambiente por 20-30 min. A chave para o sucesso de transfecção de fosfato de cálcio depende do tamanho e forma do precipitado formado. Assim, a mistura deve ser constantemente agitadas e, lentamente, para cumprir este requisito e, como conseqüência, melhorar a eficácia de transfecção. </li><li> Adicione a mistura de uma forma gotas e até mesmo em células 293T (4000 mL / frasco). Células de cultura em estufa a 37 ° C em 5% CO 2. </li><li> Substituir o meio de cultura com novas OPTI-MEM eu sem soro Médio Reduzido-Serum (50 mL / frasco) 8-10 h pós-transfecção. Continuar a células de cultura por mais dois dias na mesma condição. </li><li> Recolher o sobrenadante contendo proteínas expressas rRBD 72 h pós-transfecção. Centrifugar a 6000 rpm por 15 min para remover restos celulares. Adicionar coquetel inibidor de protease para o sobrenadante coletado e armazenar a 4 ° C durante a noite. </li><li> No dia seguinte, purificar proteínas recombinantes rRBD do sobrenadante da cultura através de instruções de Ni-NTA fabricante Superflow seguinte. </li><li> Concentre-se proteína purificada usando Amicon Ultra tubos concentração -15. Após a concentração de proteína,PBS adicionar aos tubos de concentração e centrifugar novamente para remover imidazol em tampão de eluição. Calcular a concentração de proteína e armazenar proteína purificada a -80 ° C até o uso. </li></ol></li></ol> 2. Imunização mouse e Coleta de Amostra <ol><li> Pré-aquecer Sigma sistema adjuvante (SAS) para 40-45 ° C de acordo com instruções do fabricante. Adicionar 1 mL de PBS por frasco e misturar bem. </li><li> Prepare a proteína adjuvante emulsão de acordo com o protocolo na Tabela 2. Pipeta calculada proteína rRBD em um tubo de 1,5 mL. Adicionar igual volume de adjuvante SAS para o tubo e vortex vigorosamente por 2-3 min para formar emulsão. Dica: Os volumes listados na Tabela 2 são para um mouse. Ajustar volumes de acordo com os números do mouse real usado. Para cada grupo, misture as proteínas e adjuvante necessários para cada vacina. Sempre preparar uma amostra suplementar para a vacinação para garantir a precisão. <table border="1"><tbody><tr><td> Grupo </td><td> 1 ª vacina (200 mL / rato) </td><td> 2 ª vacina (200 mL / rato) </td><td> 3 ª vacina (200 mL / rato) </td></tr><tr><td> proteína rRBD </td><td> 20 g de proteína em PBS (100 mL) + 100 mL SAS </td><td> 10 g de proteína em PBS (100 L) + 100 mL SAS </td><td> 10 g de proteína em PBS (100 L) + 100 mL SAS </td></tr><tr><td> PBS controle </td><td> 100 mL PBS + 100 mL SAS </td><td> 100 mL PBS + 100 mL SAS </td><td> 100 mL PBS + 100 mL SAS </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Protocolo de imunização do rato </li><li> Por via subcutânea prime-imunizar fêmeas BALB / c (4-6 semanas de idade, cinco ratos / grupo), e aumentar duas vezes com rRBD e SAS, conforme indicado na Tabela 2. Use PBS grupo como o controle. O site para injeções subcutâneas geralmente escolhido é a pele solta entre as omoplatas. Alternativamente, o abdômen ventral é comumente usado, porque é mais fácil para injetar, e pode observar qualquer vazamento dos locais de injeção. Quando repetidas doses de vacinas são usadas, é fácil selecionar os locais de injeção diferentes, prevenindo potenciais reacções cutâneas locais. </li><li> Sangrar camundongos via retro-orbital com anestésico antes da imunização e 10 dias após cada vacinação, soros e calor a 56 ° C por 30 min para a inativação do complemento. Loja do mouse soros a -20 ° C até o uso. </li></ol> 3. Detecção de neutralização usando ensaio de neutralização Pseudovirus <ol><li> Prepare pseudovirus SARS <ol><li> Dividir células 293T em 100 milímetros de tecido placas de cultura de petri (2x10 6 células / prato) 16 h antes da transfecção, as células crescem e como acima. </li><li> Preparar reagentes de transfecção, conforme indicado na Tabela 1. Proteína co-transfecção um plasmídeo SARS-CoV S e um plasmídeo Env-defeituoso, luciferase expressando o genoma do HIV-1 (pNL4-3.luc.RE), utilizando reagentes de transfecção de cálcio fosfato. </li><li> Substituir médio com 10 mL fresco DMEM contendo 10% FBS e 1% P / S 10/08 h pós-transfecção. Recolher o sobrenadante contendo SARS pseudovirus 72 h pós-transfecção. </li><li> Pseudovirus filtro através de um filtro mM 0,45. Alíquotas e armazenar a -80 ° C até o uso. </li></ol></li><li> SARS ensaio de neutralização pseudovirus <ol><li> Dividir células 293T expressar SARS-CoV receptor ECA2 (ACE2/293T) a 10 4 cells/100 mL / poço em placas de 96 poços de cultura de tecido 16 h antes da infecção. </li><li> Diluir pseudovirus SARS por 2 vezes para detectar o título do vírus nas células ACE2/293T. </li><li> Serialmente diluída em soro de rato placas de 96 poços de cultura de tecidos, e adicionar igual volume de titulado pseudovirus SARS. Pré-incubação das placas a 37 ° C por 1 h. </li><li> Após a incubação, adicionar 100 mL da mistura de soros para as células-pseudovirus ACE2/293T, e continuam a crescer as células a 37 ° C em 5% CO 2. Adicionar nova DMEM 24 h mais tarde. </li><li> Remover completamente o sobrenadante da cultura de placas de 72 h pós-infecção. Adicionar 1X luciferase reagente de lise celular cultura (60 mL / poço), e promover a lise celular com constante agitação de placas por 1-2 h à temperatura ambiente. </li><li> Transferência de lisados ​​celulares (50 mL / poço) em placas luminômetro (Microfluor placas de 96 poços). Adicionar substrato luciferase (50 mL / poço), incluído no sistema de análise luciferase, e detectar a atividade luciferase relativa no luminômetro 384 Ultra. </li><li> Calcule SARS título de neutralização pseudovirus e presente como título de anticorpos neutralizantes 50% (NT 50) 6. </li></ol></li></ol>

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	<li>Pitcovski, J., Gutter, B., Gallili, G., Goldway, M., Perelman, B., Gross, G., Krispel, S., Barbakov, M., Michael, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+large-scale+use+of+recombinant+VP2+vaccine+for+the+prevention+of+infectious+bursal+disease+of+chickens.">Development and large-scale use of recombinant VP2 vaccine for the prevention of infectious bursal disease of chickens.</a> Vaccine. 21, 4736-4743 (2003).</li><li>Tait, A., Hall, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theileria+annulata:+control+measures,+diagnosis+and+the+potential+use+of+subunit+vaccines.">Theileria annulata: control measures, diagnosis and the potential use of subunit vaccines.</a> Rev. Sci. Tech. 9, 387-403 (1990).</li><li>Qi, Z., Zhou, L., Zhang, Q., Ren, L., Dai, R., Wu, B., Wang, T., Zhu, Z., Yang, Y., Cui, B., Wang, Z., Wang, H., Qiu, Y., Guo, Z., Yang, R., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+mouse,+guinea+pig+and+rabbit+models+for+evaluation+of+plague+subunit+vaccine+F1+rV270.">Comparison of mouse, guinea pig and rabbit models for evaluation of plague subunit vaccine F1+rV270.</a> Vaccine. 28, 1655-1660 (2010).</li><li>Rosser, M. P., Xia, W., Hartsell, S., McCaman, M., Zhu, Y., Wang, S., Harvey, S., Bringmann, P., Cobb, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transfection+of+CHO-K1-S+using+serum-free+medium+in+suspension:+a+rapid+mammalian+protein+expression+system.">Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system.</a> Protein Expr. Purif. 40, 237-243 (2005).</li><li>Du, L., Zhao, G., Li, L., He, Y., Zhou, Y., Zheng, B. J., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenicity+and+immunogenicity+of+SARS-CoV+S+protein+receptor-binding+domain+stably+expressed+in+CHO+cells.">Antigenicity and immunogenicity of SARS-CoV S protein receptor-binding domain stably expressed in CHO cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 384, 486-490 (2009).</li><li>Du, L., Zhao, G., Chan, C. C., Sun, S., Chen, M., Liu, Z., Guo, H., He, Y., Zhou, Y., Zheng, B. J., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+expressed+in+mammalian,+insect+and+E.+coli+cells+elicits+potent+neutralizing+antibody+and+protective+immunity.">Recombinant receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein expressed in mammalian, insect and E. coli cells elicits potent neutralizing antibody and protective immunity.</a> Virology. 393, 144-150 (2009).</li><li>Ambrosino, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+270+to+510+of+the+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+spike+protein+are+required+for+interaction+with+receptor.">Amino acids 270 to 510 of the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein are required for interaction with receptor.</a> J. Virol. 78, 4552-4560 (2004).</li><li>Li, W., Moore, M. J., Vasilieva, N., Sui, J., Wong, S. K., Berne, M. A., Somasundaran, M., Sullivan, J. L., Luzuriaga, K., Greenough, T. C., Choe, H., Farzan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin-converting+enzyme+2+is+a+functional+receptor+for+the+SARS+coronavirus.">Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus.</a> Nature. 426, 450-454 (2003).</li><li>He, Y., Zhou, Y., Liu, S., Kou, Z., Li, W., Farzan, M., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+induces+highly+potent+neutralizing+antibodies:+implication+for+developing+subunit+vaccine.">Receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein induces highly potent neutralizing antibodies: implication for developing subunit vaccine.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 324, 773-781 (2004).</li><li>Batard, P., Jordan, M., Wurm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+high+copy+number+plasmid+into+mammalian+cells+by+calcium+phosphate+transfection.">Transfer of high copy number plasmid into mammalian cells by calcium phosphate transfection.</a> Gene. 270, 61-68 (2001).</li><li>Pramfalk, C., Lanner, J., Andersson, M., Danielsson, E., Kaiser, C., Renstrom, I. M., Warolen, M., James, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+receptor+activation+and+down-regulation+by+cationic+lipid+transfection+reagents.">Insulin receptor activation and down-regulation by cationic lipid transfection reagents.</a> BMC. Cell Biol. 5, 7-7 (2004).</li><li>Rosser, M. P., Xia, W., Hartsell, S., McCaman, M., Zhu, Y., Wang, S., Harvey, S., Bringmann, P., Cobb, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transfection+of+CHO-K1-S+using+serum-free+medium+in+suspension:+a+rapid+mammalian+protein+expression+system.">Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system.</a> Protein Expr. Purif. 40, 237-243 (2005).</li><li>Jiang, M., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Ca2+-phosphate+transfection+efficiency+in+low-density+neuronal+cultures.">High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures.</a> Nat. 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R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-based+transfection+method+as+a+simple+and+effective+way+to+produce+recombinant+lentiviral+vectors.">Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Densidade celular é um fator importante que afeta a eficácia de transfecção de cálcio à base de fosfato. Em nossa experiência, menos de 70% confluência das células traz os melhores resultados. Assim, a fim de melhorar a eficiência de transfecção, recomenda-se que a densidade de células ser mantidos a cerca de 50-70% de confluência. O cálcio método de transfecção de fosfato é geralmente pensado para ser menos eficiente em comparação com os métodos de transfecção outras, tais como a transfecção lipídica 16. No entanto, neste protocolo, foi utilizado um método modificado de cálcio fosfato de transfecção em que constante e lenta mistura da solução de transfecção em um vórtice garante a formação de um precipitado com o tamanho apropriado ea forma, melhorando assim a eficiência de transfecção.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7653</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Na2HPO4*7H2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S2429</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H3375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2*2H2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C5080</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12430</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HI FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10438</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>OPTI-MEM I Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>31985</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protease inhibitor cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11836170001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ni-NTA Superflow</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>30450</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sigma adjuvant system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S6322</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luciferase assay system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>E1501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luciferase cell culture lysis reagent (5X)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>E1531</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amicon Ultra - 15</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>UFC901024</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microfluor 96-well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>7905</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultra 384 luminometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tecan Systems</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

protocol for recombinant rbd-based sars vaccines: protein preparation, animal vaccination and neutralization detection

Com base em seu perfil de segurança e capacidade de induzir potentes respostas imunes contra as infecções, as vacinas de subunidades têm sido usados ​​como candidatos para uma ampla variedade de patógenos 1-3. Desde que o sistema de células de mamíferos é capaz de modificação pós-traducional, formando proteínas adequadamente dobradas e glicosilada, proteínas recombinantes expressas em células de mamíferos têm demonstrado o maior potencial para manter elevada antigenicidade e imunogenicidade 4-6. Embora nenhum novo caso de SARS têm sido relatados desde 2004, futuros surtos são uma ameaça constante e, portanto, o desenvolvimento de vacinas contra a SARS-CoV é um passo prudente preventiva e deve ser realizada. O RBD de proteína SARS-CoV S desempenha um papel importante na ligação do receptor e indução de anticorpos neutralizantes específicos contra a infecção pelo vírus 7-9. Portanto, neste protocolo, descrevemos novos métodos para o desenvolvimento de uma vacina de subunidade RBD baseada contra SARS. Resumidamente, a proteína recombinante RBD (rRBD) foi expressa em sobrenadante de cultura de células de mamíferos 293T para obter uma proteína dobrado corretamente com conformação adequada e elevada imunogenicidade 6. A transfecção do plasmídeo recombinante codificação RBD às células foi então realizada usando um método de transfecção de fosfato de cálcio 6,10 com algumas modificações. Comparado com o método de transfecção lipídica 11,12, este método modificado de cálcio fosfato de transfecção é mais barato, mais fácil de manusear, e tem o potencial para alcançar alta eficácia, uma vez um complexo de transfecção com o tamanho e forma adequadas é formado 13,14. Finalmente, um ensaio de neutralização pseudovirus SARS foi introduzida no protocolo e usado para detectar a atividade neutralizante de soros de camundongos vacinados com a proteína rRBD. Este ensaio é relativamente seguro, não envolve um infecciosas SARS-CoV, e pode ser realizada sem a exigência de um laboratório de biossegurança-3 15. O protocolo aqui descrito também pode ser usado para desenhar e estudar vacinas subunidade recombinante contra outros vírus com proteínas de classe I de fusão, por exemplo, HIV, vírus sincicial respiratório (VSR), o vírus Ebola, o vírus influenza, bem como Nipah e Handra. Além disso, os métodos para gerar um pseudovirus e, posteriormente, estabelecer um ensaio de neutralização pseudovirus pode ser aplicada a todos estes vírus.

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Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection

Este protocolo descreve um procedimento geral para o estudo de ligação aos receptores recombinantes de domínio (RBD) com base em vacinas de subunidade contra a SARS. Ele inclui métodos para transfecção e expressão da proteína em células RBD 293T, a imunização de camundongos com RBD e detecção de atividade de neutralização dos soros do mouse usando um ensaio de neutralização estabelecida SARS pseudovirus.

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Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose Herpestes Auropunctatus Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker

Análise de análogos de ácido Iofenoxico em pequeno mangusto indiano (Herpestes auropunctatus) sera para uso como um marcador biológico de vacinação contra a raiva oral

The small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) is a reservoir of rabies virus (RABV) in Puerto Rico and comprises over 70% of animal rabies cases ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

Um teste de neutralização rápido e multiplex dual reporter IgG e IgM SARS-CoV-2 para um sistema de análise de fluxo baseado em contas multiplexadas

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Detecção de anticorpo de domínio de ligação receptor sars-cov-2 usando um biorelato de domínio baseado em HiBiT

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Imagem ao vivo e quantificação da infecção viral em K18 hACE2 Camundongos transgênicos usando o recombinante SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...